全自動(dòng)固相萃取-UPLC-MS/MS法檢測(cè)清咽類(lèi)保健食品中非法添加的鹽酸二氧丙嗪和沙丁胺醇

王 任，吳鴛鴦，胡 磊，張麗媛，程巧鴛

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310052）

近年來(lái)，隨著人們自我健康意識(shí)的提高以及我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)保健食品的需求進(jìn)一步增加。一些不法商家為吸引消費(fèi)者，謀取高額利潤(rùn)，在保健食品中非法添加短期內(nèi)見(jiàn)效快、副作用大的化學(xué)藥物[1?5]，這種情況多見(jiàn)于清咽類(lèi)保健食品[6?9]。鹽酸二氧丙嗪作為一種抗組胺藥，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘和粘膜表面局麻等作用[7]。沙丁胺醇是選擇性β2受體激動(dòng)劑，可通過(guò)松弛氣道平滑肌擴(kuò)張支氣管，緩解支氣管痙攣[10]。在某些清咽類(lèi)的保健食品中添加了這兩類(lèi)化學(xué)成分[11]，以達(dá)到快速緩解咽喉不適的效果，但長(zhǎng)期食用此保健食品會(huì)導(dǎo)致機(jī)體依賴(lài)并加重病癥[12?13]，因此需要積極開(kāi)展對(duì)化學(xué)藥物非法添加檢測(cè)方法的研究。

由于保健食品基質(zhì)成分復(fù)雜，采用固相萃取凈化處理可以達(dá)到富集目標(biāo)物質(zhì)和凈化效果。傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)是人工操作，會(huì)有平行性不好，操作過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，在人工固相萃取的基礎(chǔ)上改進(jìn)的全自動(dòng)固相萃取實(shí)現(xiàn)了活化、上樣、淋洗、干燥、洗脫全過(guò)程依照程序設(shè)置自動(dòng)完成，相對(duì)傳統(tǒng)的固相萃取裝置有節(jié)約時(shí)間、溶劑和人力成本等優(yōu)勢(shì)。全自動(dòng)化的樣品前處理過(guò)程不僅可解決傳統(tǒng)固相萃取操作耗時(shí)的缺點(diǎn)，還可減少人為誤差[14?17]。已有文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)的固相萃取方法處理保健食品[17?20]，但利用全自動(dòng)固相萃取技術(shù)處理樣品的研究卻鮮有報(bào)道。同時(shí)在UPLC-MS/MS檢測(cè)過(guò)程中，基質(zhì)效應(yīng)也是不可忽略[21]，尤其是針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的保健食品，需對(duì)樣品提取液進(jìn)行有效的凈化才能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。通過(guò)混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱（MCX），可以降低UPLC-MS /MS測(cè)定過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)。

目前，保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)方法有TLC[22?23]、HPLC[24?26]、HPLC-MS /MS[7,27]、UPLCQTOF MS[28?29]法等方法。薄層色譜法易受干擾導(dǎo)致定性定量不準(zhǔn)確，而且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；高效液相色譜檢測(cè)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物質(zhì)時(shí)會(huì)有干擾，同時(shí)檢出下限較高[30?31]。而UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)能將高效液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與三重四極桿質(zhì)譜的高靈敏性和高選擇性有效結(jié)合起來(lái)，因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、定性定量更準(zhǔn)確等特點(diǎn)而被廣泛用于檢測(cè)工作。

本研究以清咽類(lèi)保健食品為研究對(duì)象，通過(guò)全自動(dòng)固相萃取技術(shù)凈化樣品，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定清咽類(lèi)保健食品中非法添加的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪，該方法前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性、準(zhǔn)確性好，適合大批量樣品中非法添加的化學(xué)物質(zhì)的快速測(cè)定，以期為保健食品中非法化學(xué)物質(zhì)添加監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

保健食品樣品 基質(zhì)包括含片（立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片，都樂(lè)牌金嗓子喉片）、糖果（京都念慈菴琵琶糖，潘高壽胖大海潤(rùn)喉糖）以及液體（京都念慈菴蜜煉川貝枇杷膏，同仁堂枇杷秋梨膏）3種劑型，國(guó)家、省級(jí)抽檢及市售；甲酸銨、甲酸、甲醇、乙腈 均為色譜純，Sigma 公司；氨水、乙酸銨 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；水 超純水；沙丁胺醇對(duì)照品（含量99.7%，批號(hào)100204-201103）、鹽酸二氧丙嗪對(duì)照品（含量99.9%，使用前105℃干燥2 h，批號(hào)100299-201202）中國(guó)食品藥品檢定研究院；CQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC-C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）、Oasis HLB固相萃取柱（3cc/60 mg）、Oasis MCX固相萃取柱（3cc/60 mg）Waters；ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8μm） Agilent ；C18固相萃取柱（200 mg） Agela。

1290-G6460QQQ三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫；Fotector Plus型高通量全自動(dòng)固相萃取儀 ?？乒?；Genpure Pro UV/UF超純水系統(tǒng) 美國(guó)熱電公司；MS205DU 電子天平 瑞士梅特勒-托麗多儀器公司；P300H超聲波清洗器 德國(guó)艾爾瑪公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱(chēng)取沙丁胺醇對(duì)照品42.84 mg至100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，超聲10 min（200 W，30 k Hz），放冷，甲醇定容，即得沙丁胺醇儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取鹽酸二氧丙嗪對(duì)照品49.28 mg于100 mL棕色量瓶中，甲醇溶解，超聲10 min （200 W，30 kHz），放冷，甲醇定容，即得鹽酸二氧丙嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精確移取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和鹽酸二氧丙嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL于100 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃保存。

1.2.2 供試品溶液制備

1.2.2.1 提取 取一次口服劑量供試品（片劑：立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片）（糖果和液體劑型也取相當(dāng)于一次口服劑量），研細(xì)，精確稱(chēng)取0.5 g（精確到0.0001 g），置于50 mL棕色容量瓶中，加 p H5.2的0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液25 mL，超聲10 min （200 W，30 kHz），加約20 mL 甲醇溶解，超聲10 min （200 W，30 kHz），放冷，甲醇定容[32]。

1.2.2.2 凈化 將提取液全部轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)固相萃取儀中進(jìn)行凈化富集，采用MCX固相萃取柱，凈化富集程序見(jiàn)表1。收集洗脫液于10 mL試管中，40℃下吹氮至近干，用10%甲醇水溶液（內(nèi)含0.1%甲酸）溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移定容至50.0 mL容量瓶，得到待測(cè)液，待測(cè)液經(jīng)過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后待上機(jī)測(cè)定。

表1 全自動(dòng)固相萃取儀的凈化富集程序Table 1 Program of purification and enrichment by the automatic solid phase extraction installation

1.2.3 陰性空白樣品溶液制備 取供試品的陰性空白基質(zhì)（立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片：未檢出待測(cè)化合物），按“1.2.2”項(xiàng)下條件制備陰性空白樣品溶液。

1.2.4 UPLC-MS/MS的色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱；柱溫：25℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：1.0μL；梯度洗脫：流動(dòng)相A為含有10 mmol/L甲酸銨的0.1%（v/v）甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流動(dòng)梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相梯度表Table 2 Flow phasegradient table

1.2.5 UPLC-MS/MS的質(zhì)譜條件 掃描方式：電噴霧離子源（ESI+），正離子模式掃描模式；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描；毛細(xì)管電壓：3000 V；離子源溫度：300℃；脫鞘氣流速：11 L/min，霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?。?yōu)化后相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜MRM參數(shù)Table 3 Mass spectrometry parameters

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用QQQ quantitative analysis.B0700和Excel 2003軟件進(jìn)行平均值、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇及優(yōu)化

沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪均易溶于極性溶劑。本試驗(yàn)探索了不同提取液對(duì)待測(cè)物提取效率的影響，樣品經(jīng)不同溶劑提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化，復(fù)溶上樣分析。本試驗(yàn)選取100%甲醇、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（2:5，v/v）、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:5，v/v）、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:2，v/v）進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。待測(cè)加標(biāo)樣品過(guò)MCX固相萃取柱凈化后，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)100%甲醇提取液提取的待測(cè)溶液中沙丁胺醇回收率為0，鹽酸二氧丙嗪回收率為98.2%～98.6%，RSD為2.1%～3.0%。乙酸銨緩沖溶液:甲醇（2:5，v/v）提取液提取的待測(cè)溶液中沙丁胺醇回收率為88.5%～90.1%，RSD為3.5%～3.9%，鹽酸二氧丙嗪回收率達(dá)到95%以上，隨著乙酸銨緩沖溶液在提取溶液中的比例增加，沙丁胺醇回收率提高并趨于穩(wěn)定，維持在95%（RSD<5%）以上，而鹽酸二氧丙嗪回收率未有太大改變。這是因?yàn)樯扯“反荚谝宜徜@緩沖溶液的提取液里帶有正電荷，過(guò)MCX固相萃取柱后可以與其通過(guò)靜電作用結(jié)合，而在100%甲醇提取液里無(wú)法與MCX固相萃取柱結(jié)合從而被洗脫下來(lái)[33]。同時(shí)基于環(huán)保與成本考慮，本試驗(yàn)選用乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:5，v/v）作為提取溶液。

圖1 不同提取溶劑及溶劑比例對(duì)待測(cè)物回收率的影響（n=3）Fig.1 Effect of different extraction solvents and solvent ratio on recoveries(n=3)

2.2 固相萃取柱優(yōu)化

由于保健品基質(zhì)較為復(fù)雜，其中的糖類(lèi)、色素等雜質(zhì)會(huì)干擾目標(biāo)物的檢測(cè)，在進(jìn)行前處理時(shí)，需要消除這些雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾，因此需對(duì)提取后的溶液進(jìn)行凈化處理。本試驗(yàn)考察了C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱及MCX固相萃取柱對(duì)沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱對(duì)沙丁胺醇并無(wú)保留，鹽酸二氧丙嗪的回收率較好，均達(dá)90%以上，RSD<5%。而MCX固相萃取柱的使用方法是先用酸化的試劑進(jìn)行清洗后再用堿化試劑洗脫，溶液中的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪經(jīng)MCX固相萃取柱凈化后均獲得了較高的回收率，且重復(fù)性較好，其中待測(cè)兩種物質(zhì)的加標(biāo)回收率均達(dá)90%以上，RSD<5%。因?yàn)镸CX固相萃取柱有效整合了C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱的優(yōu)點(diǎn)，組分中既包含與C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱類(lèi)似的疏水基團(tuán)，可以通過(guò)疏水作用去除提取液中的糖、色素等雜質(zhì)，又包含強(qiáng)陽(yáng)離子基團(tuán)（磺酸基），可通過(guò)靜電作用力吸附待測(cè)的沙丁胺醇，通過(guò)淋洗液和洗脫液的合理選擇實(shí)現(xiàn)保健食品中待測(cè)物質(zhì)的有效凈化。因此，試驗(yàn)選用MCX型固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化富集。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)待測(cè)物回收率的影響（n=3）Fig.2 Effectsof different SPE columnson the recoveries of subjects (n=3)

2.3 洗脫溶劑優(yōu)化

洗脫溶劑的選擇是影響待測(cè)物質(zhì)回收率的一個(gè)重要因素。本試驗(yàn)選取不同比例的氨水與甲醇洗脫液對(duì)回收率的影響進(jìn)行考察。氨水與甲醇比例分別設(shè)置為0.5:100（v/v），1:100（v/v），3:100（v/v），5:100（v/v），10:100（v/v）和100%甲醇。由圖3可知，100%甲醇洗脫的加標(biāo)待測(cè)樣品中沙丁胺醇回收率為0，鹽酸二氧丙嗪回收率為90%（RSD<5%）以上，而0.5%氨水甲醇洗脫的加標(biāo)待測(cè)樣品回收率為82.9%～83.6%，RSD為3.1%～4.0%，隨著氨水的比例提高，待測(cè)樣品加標(biāo)回收率也相應(yīng)提高，當(dāng)氨水比例達(dá)到3%時(shí)，兩種待測(cè)物質(zhì)回收率均在90%（RSD<5%）以上。因?yàn)樯扯“反挤肿咏Y(jié)構(gòu)含有氨基結(jié)構(gòu)，堿性洗脫劑通過(guò)改變離子強(qiáng)度和破壞分子間力，使目標(biāo)化合物被洗脫下來(lái)，得到了較高的回收率。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)最終選擇3%氨水甲醇為洗脫溶液，可在不影響待測(cè)化合物回收率的前提下，較好地的去除提取液中的極性雜質(zhì)，凈化基質(zhì)。

圖3 不同比例的氨水和甲醇洗滌液對(duì)回收率的影響（n=3）Fig.3 Effectsof different proportionsof ammonia water and methanol on the recovery (n=3)

2.4 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8μm）以及ACQUITY UPLC BEH HILIC-C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）3種色譜柱的分離效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。在同等色譜條件下，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪在3種色譜柱上都可以得到較好的分離。但是沙丁胺醇在ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）柱上峰形對(duì)稱(chēng)，相應(yīng)較高，且保留時(shí)間最短。這是因?yàn)锳CQUITY UPLC BEH C18是端基封尾的色譜柱，且固定相無(wú)殘留的硅羥基，可以改善峰形，同時(shí)耐受p H更廣。因此選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱進(jìn)行分離。

圖4 色譜柱分離效果對(duì)比Fig.4 Comparison of chromatographic column separation effect

2.5 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相是影響色譜峰形狀和分離度的一個(gè)重要條件。本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，分別考察了甲醇-0.1%甲酸，甲醇-10 mmol/L甲酸銨和甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）系統(tǒng)。在流動(dòng)相中加入揮發(fā)性有機(jī)酸即可以提高離子化效率，同時(shí)也有利于樣品的溶解，故在流動(dòng)相中添加甲酸。結(jié)果顯示，盡管3個(gè)系統(tǒng)都可以得到較好的峰形和分離度，但是正離子模式下，在水溶液中添加一定濃度的甲酸能夠有效地提高分析物離子化的效率[16]，試驗(yàn)以甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）對(duì)待測(cè)物進(jìn)行梯度洗脫，獲得的峰靈敏度更高。在保證實(shí)驗(yàn)靈敏度的前提下，最終采用甲醇?0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）系統(tǒng)。

2.6 子離子選擇及碰撞能優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪較易得到一個(gè)質(zhì)子得到母離子，所以2種化合物均采用正離子模式，分別得到一個(gè)質(zhì)子形成母離子[M+H]＋。在正離子模式下，分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描（Q1掃描）、二級(jí)質(zhì)譜掃描（子離子掃描）和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描。在Q1掃描中找出每個(gè)化合物的母離子，在子離子掃描中找到響應(yīng)較大的子離子，最后在MRM 掃描下優(yōu)化碰撞能參數(shù)，選擇響應(yīng)較高、穩(wěn)定性好的1個(gè)子離子作為定量離子，1個(gè)子離子作為定性離子。結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 混合對(duì)照品溶液PI圖Fig.5 Mixed control solution picture of PI

圖7 混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和供試品（含片Ⅰ）的MRM質(zhì)譜圖Fig.7 Mixed standard curve solution and sample (LozengeⅠ)solution pictures of MRM

2.7 基質(zhì)效應(yīng)影響

圖6 混合對(duì)照品對(duì)應(yīng)二級(jí)MS質(zhì)譜圖Fig.6 Mixed control solution PI pictures of secondary mass spectrum

采用質(zhì)譜進(jìn)行定量分析時(shí)需要考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。保健食品基質(zhì)較為復(fù)雜，經(jīng)簡(jiǎn)單處理后依然有多種非待測(cè)物質(zhì)保留在樣品溶液里[34]，進(jìn)入電離源時(shí)會(huì)對(duì)目標(biāo)物的離子化過(guò)程產(chǎn)生干擾，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度造成一定影響，進(jìn)而影響試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。本試驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量法：添加40 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成基質(zhì)加標(biāo)液，與流動(dòng)相加標(biāo)溶液進(jìn)行比較，空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（A）和甲醇中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（B）的比值考察基質(zhì)效應(yīng)（ME），ME=A/B×100%，當(dāng)ME<1時(shí)，說(shuō)明存在基質(zhì)抑制作用；當(dāng)ME>1時(shí)，說(shuō)明存在基質(zhì)增強(qiáng)作用[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸二氧丙嗪在保健品基質(zhì)中的ME為0.94～0.98，而鹽酸二氧丙嗪在保健品基質(zhì)中的ME為0.78～0.83，鹽酸二氧丙嗪存在一定的抑制效果，為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量法。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)下限

本實(shí)驗(yàn)采用陰性空白基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。以各定量離子色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得到檢出限（LOD）；以10倍信噪比（S/N）計(jì)算得到定量限（LOQ）。各回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果顯示這2種化學(xué)物質(zhì)在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.999，表明本方法可以對(duì)含有這2個(gè)化學(xué)成分的樣品進(jìn)行定量分析。

表4 2個(gè)化學(xué)成分的線(xiàn)性回歸方程及檢出限和定量限Table 4 Linear regression equations,LOD and LOQof two components

2.9 精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一濃度混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液驗(yàn)證精密度，按照“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)下的液相和質(zhì)譜的條件進(jìn)行分析，進(jìn)行6次平行測(cè)試，分別計(jì)算2個(gè)化學(xué)成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的峰面積RSD均在1.3%～2.7%之間，均<5%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的儀器精密度，符合分析測(cè)定的要求。選取同一加標(biāo)樣品共6份，按照“1.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行前處理得到供試品溶液，按照“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)下的液相和質(zhì)譜的條件進(jìn)行分析，同一批進(jìn)樣，結(jié)果表明檢出的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪含量的重復(fù)性RSD均在1.1%～1.9%之間，均<5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一濃度混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液測(cè)定穩(wěn)定性，分別于1.0、4.0、10.0、15.0、20.0、24.0 h注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，以沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的各自定量離子峰面積為指標(biāo)，測(cè)定其RSD。結(jié)果表明沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的穩(wěn)定性RSD分別為3.1%和4.1%。表明沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.11 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取陰性空白樣品（片劑、糖果和液體劑型）各9份，按照1倍檢出限（2μg/kg）、3倍檢出限（5μg/kg）和5倍檢出限（10μg/kg）加入適量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)下的液相和質(zhì)譜的條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，如表5所示，結(jié)果得片劑中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為90.8%～95.2%和92.8%～98.7%，RSD分別為1.2%～2.0%和0.83%～3.1%；糖果劑型中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為87.4%～94.8%和90.1%～98.8%，RSD分別為1.6%～3.9%和2.0%～3.7%；液體劑型中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為89.9%～95.2%和92.8%～98.6%，RSD分別為1.6%～2.4%和1.2%～1.8%。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度滿(mǎn)足試驗(yàn)需求。

表5 供試品的加標(biāo)回收率和偏差（n=3）Table 5 Recoveries and RSD(n=3)

2.12 實(shí)際樣品測(cè)定

此次實(shí)驗(yàn)選取以含片、糖果以及液體劑型為主的國(guó)家抽檢和省級(jí)抽檢保健食品6批次。按照“1.2.2”項(xiàng)下條件備供試品溶液，按“1.2.4和1.2.5中的液相和質(zhì)譜的條件進(jìn)行分析檢測(cè)沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪。含片、糖果以及液體樣品均未檢出沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法，結(jié)合全自動(dòng)固相萃取儀，建立清咽類(lèi)保健食品中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的同時(shí)快速測(cè)定方法，外標(biāo)法定量，并對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化。相比于傳統(tǒng)人工過(guò)固相萃取柱的方法，本試驗(yàn)建立了基于混合型陽(yáng)離子固相萃取柱的全自動(dòng)固相萃取的前處理方法，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少人力本，減少人工誤差，實(shí)現(xiàn)了固相萃取流速的可控性，提高了試驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，縮短了樣品處理周期，適用于大批量樣品的前處理。該方法同時(shí)對(duì)色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)清咽類(lèi)保健品中非法添加的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪進(jìn)行定性和定量分析。故本文方法的建立能為檢測(cè)清咽類(lèi)保健食品中非法添加化學(xué)成分檢測(cè)提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)提高保健食品安全事件的應(yīng)急處理能力具有重要的參考意義。