基于頂空氣相-離子遷移色譜的不同品種番荔枝揮發(fā)性成分比較

楊濤華，張晴雯，龔 霄, ，李積華, ，周 偉

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001）

番荔枝（Annona squamosaLinn.），為番荔枝科番荔枝屬落葉喬木。果肉滋味甜，口感細(xì)膩綿密，營(yíng)養(yǎng)豐富，是熱帶地區(qū)代表性水果之一。番荔枝風(fēng)味獨(dú)特，不同品種番荔枝揮發(fā)性化合物組成和含量不同，因此導(dǎo)致了番荔枝香氣的品種間差異[1]，故而香氣可以作為番荔枝分類的重要參考指標(biāo)。

近年來(lái)，常用于鑒定食品中揮發(fā)性香氣化合物的儀器分析技術(shù)主要有：氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS）[2]，氣相色譜-嗅覺(jué)法-質(zhì)譜（Gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）[3]和電子鼻[4]。但這些技術(shù)均受限于預(yù)處理程序和樣品種類要求，無(wú)法滿足快速檢測(cè)分析的要求[5?6]。離子遷移譜（Ion mobility spectrometry，IMS）作為一種新興技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、樣品制備步驟簡(jiǎn)單，將IMS與氣相色譜結(jié)合使用可以更好地表征風(fēng)味成分[7]。

氣相色譜-離子遷移譜儀（Gas chromatographyion mobility spectrometry，GC-IMS）結(jié)合了GC的高分離能力和IMS的快速響應(yīng)特性提供了一種新的氣相分離和檢測(cè)技術(shù)。已廣泛用于食品風(fēng)味分析、可卡因等非法藥物的痕量檢測(cè)[8]以及通過(guò)檢測(cè)人呼出氣體揮發(fā)性有機(jī)化合物和人類皮膚釋放揮發(fā)性化合物監(jiān)測(cè)和預(yù)先判別疾病[9?10]等，尤其是食品風(fēng)味分析。不僅用于分析特征風(fēng)味，如白葡萄酒的分類鑒別[11]，以蛋殼表面呼吸物的含量和濃度來(lái)判別雞蛋的新鮮程度[12]，伊比利亞火腿的摻假鑒別[13]，棗果變黑過(guò)程中棗果實(shí)成分和揮發(fā)性化合物的含量變化[14]，還有將HS-GC-IMS成像與化學(xué)計(jì)量學(xué)和分子標(biāo)記識(shí)別結(jié)合來(lái)區(qū)分不同花源蜂蜜和摻假蜂蜜[15]、山茶油摻假鑒別[16]、肉品分類[17]、番荔枝貯藏品質(zhì)評(píng)價(jià)[18]等。在水果風(fēng)味化合物分析領(lǐng)域，楊帆等[19]采用頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）和全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（GC×GC-0-MS）結(jié)合分別分析新鮮和熱處理西瓜汁中的氣味化合物，確定了2,6-二甲基-5-庚烯醛是西瓜產(chǎn)生甜瓜、清香氣味的化合物，而包括戌醛、己醛、2-戊基呋喃、辛醛等化合物含量在熱處理前后的變化則導(dǎo)致西瓜汁熱處理后產(chǎn)生蒸煮味和含硫味。于懷智等[20]應(yīng)用頂空氣相離子遷移譜技術(shù)分析了不同產(chǎn)地水蜜桃揮發(fā)性有機(jī)物差異，通過(guò)建立相應(yīng)的指紋圖譜能較高效地鑒別不同產(chǎn)地水蜜桃。李湘等[21]基于氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析不同處理前后柑橘果皮揮發(fā)性化合物變化，采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）篩選出17個(gè)標(biāo)志揮發(fā)性化合物（VIP>1），并對(duì)其進(jìn)行熱圖聚類分析，發(fā)現(xiàn)了不同處理對(duì)柑橘果皮揮發(fā)性化合物的影響。事實(shí)證明，在水果等食品風(fēng)味分析領(lǐng)域，GC-IMS以其高效無(wú)損、操作簡(jiǎn)單、靈敏度強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于表征揮發(fā)性化合物[22?23]。因此，利用GC-IMS技術(shù)檢測(cè)番荔枝風(fēng)味物質(zhì)，并根據(jù)特征風(fēng)味化合物構(gòu)建品種指紋圖譜和鑒別模型是可以實(shí)現(xiàn)的。

本試驗(yàn)利用GC-IMS技術(shù)檢測(cè)番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝等4種番荔枝的香氣成分，建立不同品種番荔枝揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜。根據(jù)數(shù)據(jù)的差異性，對(duì)不同品種番荔枝進(jìn)行區(qū)分，為番荔枝品種識(shí)別、全品種香氣研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番鬼荔枝 采購(gòu)于廣東徐聞馬以貿(mào)易有限公司；大目番荔枝 購(gòu)于廣西百色平果縣；紅番荔枝采購(gòu)于廣東徐聞馬以貿(mào)易有限公司；刺果番荔枝 購(gòu)于海南儋州翊盛貿(mào)易有限公司，采后全程冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

FlavourSpec?風(fēng)味分析儀 德國(guó)G.A.S公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理方法 由于新鮮番荔枝果肉風(fēng)味化合物不穩(wěn)定、逸散不充分，易導(dǎo)致檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。且使用新鮮果肉進(jìn)行揮發(fā)性化合物測(cè)定常以4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)檢測(cè)出的揮發(fā)性化合物進(jìn)行相對(duì)定量，檢測(cè)結(jié)果存在較大誤差。因此本試驗(yàn)采用果肉速凍粉末進(jìn)行風(fēng)味分析。具體操作如下：番荔枝去皮，并將果肉快速切成薄片。將果肉液氮速凍并研磨成粉末，準(zhǔn)確稱量2.0 g粉末于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，用作香氣試驗(yàn)。每個(gè)樣品做三次平行試驗(yàn)。

1.2.2 GC-IMS檢測(cè)條件 頂空孵化溫度：60℃；孵化時(shí)間：10 min；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min；頂空進(jìn)樣針溫度：65℃；進(jìn)樣量：500μL，不分流模式；清洗時(shí)間：0.50 min；色譜柱為FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm，柱溫60℃，色譜運(yùn)行時(shí)間20 min，載氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%）；設(shè)置程序：流速2.00 mL/min，并保持2 min，在20 min內(nèi)線性增至100.00 mL/min。IMS條件：IMS溫度為45℃，載氣為高純氮?dú)猓ā?9.99%）；流速150.00 mL/min。將頂空進(jìn)樣瓶中的樣品進(jìn)行孵化，使用加熱的進(jìn)樣針抽取瓶?jī)?nèi)的頂空組分，GCIMS分析測(cè)定。定性定量方法：將IMS數(shù)據(jù)庫(kù)里相應(yīng)揮發(fā)性化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參考基準(zhǔn)，一一對(duì)應(yīng)測(cè)定樣品揮發(fā)性化合物的種類及含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配套的分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC×IMSLibrary Search，進(jìn)行多角度樣品分析。LAV軟件：用于查看分析譜圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物；對(duì)其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后可進(jìn)行定量分析。Reporter插件：直接對(duì)比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和三維譜圖）。Gallery Plot插件：指紋圖譜對(duì)比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異。Dynamic PCA插件：動(dòng)態(tài)主成分分析，用于將樣品聚類分析，以及快速確定未知樣品的種類。GC×IMS Library Search：應(yīng)用軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

風(fēng)味物質(zhì)濃度以μg/L表示。用GC-IMS測(cè)得風(fēng)味物質(zhì)的峰強(qiáng)度單位為ppb，將ppb作為濃度單位換算成μg/L，參考基準(zhǔn)是IMS數(shù)據(jù)庫(kù)里相應(yīng)揮發(fā)性化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用軟件SPSS V 20版（IBM SPSS Statistics 20）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。處理三個(gè)平行數(shù)據(jù)并將其最終表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種番荔枝特征風(fēng)味氣相-離子遷移色譜（GC-IMS）譜圖分析

圖1、圖2分別是LAV軟件中Reporter插件所制作的三維譜圖和俯視圖。從三維譜圖（圖1）中可以直觀看到四種番荔枝間含有揮發(fā)性化合物的種類及含量存在差異，除了獨(dú)有的揮發(fā)性化合物外，四種番荔枝均有的揮發(fā)性化合物含量也不同。而在俯視圖（圖2）中：RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。圖2中的物質(zhì)編號(hào)對(duì)應(yīng)表1中化合物。

圖1 不同品種番荔枝果肉特征風(fēng)味的GC-IMS三維譜圖Fig.1 Three dimensional GC-IMSimagesof characteristic flavor of different Annona squamosa Linn. pulp

結(jié)合三維譜圖和俯視圖，能初步判斷出刺果番荔枝（d）揮發(fā)性化合物的種類明顯區(qū)別于其他三種，且揮發(fā)性化合物含量更為豐富。根據(jù)表1，同一種揮發(fā)性化合物的含量在不同品種番荔枝樣品中存在顯著差異。結(jié)合俯視圖（圖2）和番荔枝果肉揮發(fā)性物質(zhì)表（表1）的分析可以得出，刺果番荔枝的風(fēng)味成分以丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等酯類物質(zhì)為主，且丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯幾種成分在刺果番荔枝中的含量水平為300μg/L，遠(yuǎn)高于這幾種成分在其它3種番荔枝為30μg/L左右的含量水平。而酯類能顯著影響成熟水果的特征風(fēng)味，給水果帶來(lái)柑橘類清新香氣[24?25]。番鬼荔枝、大目番荔枝和紅番荔枝中則以檸檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯等萜烯類物質(zhì)為主，而萜烯類物質(zhì)給水果帶來(lái)令人愉悅的玫瑰和檸檬香氣[24?25]。檸檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯在番鬼荔枝、大目番荔枝和紅番荔枝中含量（200～300 μg/L）遠(yuǎn)高于其在刺果番荔枝中的含量（3～10μg/L），且存在顯著差異（P<0.05）。刺果番荔枝中萜烯類物質(zhì)含量較低，含量水平處于0.25～3.5μg/L，因此刺果番荔枝無(wú)明顯玫瑰和檸檬香氣，這可作為快速判斷刺果番荔枝的重要指標(biāo)。

表1 番荔枝果肉揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile compounds of Annona squamosa Linn.pulp

圖2 番荔枝果肉特征風(fēng)味的GC-IMS譜圖Fig.2 GC-IMSimages of characteristic flavor of Annona squamosa Linn. pulp

2.2 不同品種番荔枝特征風(fēng)味離子遷移色譜（GCIMS）指紋圖譜分析

有機(jī)指紋圖譜中每一行代表一個(gè)番荔枝果肉中選取的全部信號(hào)峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同番荔枝果肉中的信號(hào)峰。從圖3中可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性有機(jī)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。

由圖3可知：不同品種番荔枝果肉的揮發(fā)性化合物組分差異顯著，均存在各自特征風(fēng)味物質(zhì)區(qū)域。番鬼荔枝（a）的特征風(fēng)味物質(zhì)，即菱形標(biāo)記的芳樟醇（風(fēng)信子香）、1,8-桉葉素、苯甲醛（苦杏仁香）、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物質(zhì)，這些物質(zhì)在番鬼荔枝（a）中含量較高，給其帶來(lái)了風(fēng)信子和苦杏仁香氣；大目番荔枝（b）的特征風(fēng)味物質(zhì)，則是三角形標(biāo)記的檸檬烯、月桂烯、莰烯（柔和樟腦香）、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇（生青、青草）、己醛、2-己酮、丙酮（薄荷香）、丁醛等物質(zhì)含量較高；刺果番荔枝（d）的特征風(fēng)味物質(zhì)，即圓形標(biāo)記的E-2-己烯醇（生青味、草藥味）、丙酸乙酯、辛酸乙酯（果香，菠蘿、梨香，花香）、丁酸己酯、辛酸甲酯（蠟味、蘋(píng)果皮味、果香）、己酸乙酯（花香、果香）、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯（蘋(píng)果、草莓、香蕉味）、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯（果香、苦味）、E-2-辛烯醛、1-辛醇（濃郁的柑橘、玫瑰）、3-甲基丁醇、2-庚酮（梨、香蕉味）、2-戊酮、乙酸乙酯（蘋(píng)果味）、乙醇、3-甲基丁醛等物質(zhì)含量較高；紅番荔枝（c）的風(fēng)味物質(zhì)濃度較低，番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝中存在較多的萜烯類物質(zhì)，而刺果番荔枝則以酯類物質(zhì)為主，與Costa、Cheong等[26?27]的研究結(jié)論相一致。

圖3 番荔枝果肉特征風(fēng)味的指紋圖譜Fig.3 Fingreprients information of characteristic flavor of Annona squamosa Linn.pulp

不同揮發(fā)性化合物組分會(huì)讓樣品呈現(xiàn)不同的香氣感受。芳樟醇會(huì)帶來(lái)風(fēng)信子[28]的香氣，1-己醇、丙酮、E-2-己烯醇會(huì)給樣品帶來(lái)青草、薄荷等草本類植物香氣[28]。而辛酸乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、1-辛醇、2-庚酮、乙酸乙酯常被描述為花果類香氣[29]。

2.3 不同品種番荔枝特征風(fēng)味主成分分析

采用LAV軟件Dynamic PCA插件，對(duì)番荔枝果肉樣品進(jìn)行主成分分析（PCA），觀察圖4A可得：前兩個(gè)主成分上方差累計(jì)貢獻(xiàn)率91.986%，其中第一主成分（PC1）是73.285%，第二主成分（PC2）是18.701%。在主成分分析圖中，可以直觀看到四種番荔枝各自聚類，區(qū)分度明顯。

由樣品風(fēng)味物質(zhì)的得分與載荷圖即圖4B中可知，刺果番荔枝（d）與酯類和酮類化合物距離較近，說(shuō)明刺果番荔枝（d）中酯類、酮類化合物含量較高，更多地呈現(xiàn)出花果類香氣；番鬼荔枝（a）與苯甲醛等醛類化合物距離較近，即番鬼荔枝（a）中苯甲醛含量較高，而苯甲醛通常表現(xiàn)為苦杏仁香氣；蒎烯、松油烯、羅勒烯、月桂烯、檸檬烯、莰烯等萜烯類化合物與紅番荔枝（c）位置接近，說(shuō)明紅番荔枝（c）含有上述多種的萜烯類化合物，因此香氣以萜烯類化合物呈現(xiàn)的草本類香氣為主。

圖4 番荔枝風(fēng)味成分得分與載荷圖Fig.4 Score and load chart of aroma compounds of Annona squamosa Linn.samples

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用GC-IMS技術(shù)檢測(cè)番荔枝香氣成分，通過(guò)對(duì)番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝四個(gè)不同品種番荔枝香氣成分的分析和比較，確定了各品種特征香氣成分以及特征信號(hào)峰。研究發(fā)現(xiàn)：在番鬼荔枝中，芳樟醇、1,8-桉葉素、苯甲醛、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物質(zhì)含量較高；而檸檬烯、月桂烯、莰烯、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇、己醛、2-己酮、丙酮、丁醛等物質(zhì)在大目番荔枝中含量較高；刺果番荔枝中E-2-己烯醇、丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯、E-2-辛烯醛、1-辛醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、2-戊酮、乙酸乙酯、乙醇、3-甲基丁醛等物質(zhì)含量較高。紅番荔枝的風(fēng)味物質(zhì)濃度較低。參考利用揮發(fā)性有機(jī)物差異鑒別水蜜桃產(chǎn)地[20]的研究思路，進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)PCA能基于香氣成分對(duì)番荔枝品種進(jìn)行有效區(qū)分，4種番荔枝與其特征風(fēng)味化合物各自聚類，結(jié)果顯示番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝檢出的揮發(fā)性化合物以萜烯類物質(zhì)為主，而刺果番荔枝中酯類物質(zhì)占比較大。

GC-IMS作為近年來(lái)食品風(fēng)味化學(xué)領(lǐng)域熱門(mén)的技術(shù)手段，已在酒類[11]、蜂蜜[15]、水果風(fēng)味化合物檢測(cè)[19?21]等方面進(jìn)行了探索并得到了一些研究結(jié)論。本研究比較了番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝的香氣成分并構(gòu)建了四種番荔枝香氣成分指紋圖譜，但截止目前，由于IMS數(shù)據(jù)庫(kù)在番荔枝風(fēng)味領(lǐng)域的數(shù)據(jù)還不完善，只定性定量出49種揮發(fā)性化合物，需要進(jìn)一步檢測(cè)其它不同品種番荔枝的風(fēng)味物質(zhì)，擴(kuò)充番荔枝風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，為構(gòu)建全品種番荔枝風(fēng)味物質(zhì)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。