基于遺傳算法-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的豆渣酶解工藝優(yōu)化及其動(dòng)力學(xué)研究

謝春平，趙良忠, ，李 明，周曉潔，黃展銳，莫 鑫，車麗娜，庾 坤

（1.邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南邵陽 422000；3.湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南邵陽 422000；4.廣州佳明食品科技有限公司，廣東廣州 511458）

豆渣是大豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物，其營養(yǎng)成分豐富[1?2]，其中被譽(yù)為“第七大營養(yǎng)素”的膳食纖維約占豆渣干物質(zhì)的60%[3?5]。但由于口感粗糙、水分含量極高（達(dá)85%），不易儲(chǔ)藏，有效利用率低，大部分豆渣被直接丟棄，不僅浪費(fèi)資源，還污染環(huán)境[6]。據(jù)中國豆制品行業(yè)協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年用于豆制品加工的大豆約為800萬噸，以加工1噸大豆產(chǎn)生1.5噸濕豆渣計(jì)，豆制品加工年產(chǎn)濕豆渣量在1200萬噸以上[7?9]。巨量的豆渣如何進(jìn)行利用，提高其附加值，是值得研究的課題之一。

研究表明，利用酶可提取豆渣中的可溶性膳食纖維（SDF）[10]、不溶性膳食纖維（IDF）[11]、多糖[12]、大豆多肽[13]等。目前酶水解豆渣的研究主要是不完全水解產(chǎn)物（SDF、多糖等）的工藝優(yōu)化及應(yīng)用，而植物纖維酶解動(dòng)力學(xué)也是傾向于玉米芯[14]、燕麥殼[15]、小麥秸稈[16]等，關(guān)于豆渣酶解生成還原糖的工藝及其酶解動(dòng)力學(xué)的研究鮮為報(bào)道。常見優(yōu)化方法有正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)（RSM）[18?19]、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）[20]等，幾種方法各有優(yōu)劣但未見討論不同優(yōu)化方法對(duì)豆渣酶解效果的影響。

因此，本文主要研究在豆渣酶解過程中p H、纖維素酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)還原糖生成量的影響，通過RSM與GA-ANN兩種方法優(yōu)化出豆渣酶解生成還原糖的最佳工藝。并且在豆渣酶解優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究豆渣的酶解動(dòng)力學(xué)，以期為豆渣高效利用和后期全豆豆腐產(chǎn)品研究提供技術(shù)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆渣 熟漿工藝生產(chǎn)豆?jié){所得的副產(chǎn)物，豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；FDY-2243型纖維素酶 酶活11000 U/mL，夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

MZJJ-1型熟漿生產(chǎn)設(shè)備 北京康得利智能制造有限公司；QDSJ9000-2型濕法超細(xì)精磨機(jī) 無錫輕大食品裝備有限公司；Atomo3.0型均質(zhì)機(jī)BERTOLI；UV-1780型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 采用機(jī)械粉碎的方法處理豆渣。選取新鮮的豆渣（水分含量為79.3%），添加3倍豆渣質(zhì)量的水進(jìn)行濕法粉碎，再將粗粉碎后的豆渣液進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)壓力為35 MPa，物料經(jīng)均質(zhì)后，待用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以預(yù)處理豆渣液100 g為基準(zhǔn)，分別以p H、纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以還原糖生成量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究各因素的較優(yōu)水平。固定p H為5.4、纖維素酶添加量為4%、酶解溫度為55℃、酶解時(shí)間為2 h，實(shí)驗(yàn)水平設(shè)定pH為4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0；纖維素酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%、6%（以豆渣液干物質(zhì)的量計(jì)算）；酶解溫度為40、45、50、55、60、65℃；酶解時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取各因素較優(yōu)水平，以還原糖生成量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface experimental design

1.2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）模型構(gòu)建 本研究采用3層的ANN模型創(chuàng)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化模型，三層網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)分別由輸入層、隱含層和輸出層構(gòu)成[11,21]。將p H、纖維素酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間設(shè)定為輸入層神經(jīng)元，還原糖生成量設(shè)定為輸出層神經(jīng)元，以“traingdm”為訓(xùn)練函數(shù)，29組RSM數(shù)據(jù)為實(shí)際樣本，各變量增加±Δi（Δi=0.2%），采用正交L8（27），生成232個(gè)虛擬樣本，結(jié)合29組實(shí)際樣本，共261組樣本作為訓(xùn)練樣本，從上至下的230組數(shù)據(jù)的60%用于訓(xùn)練、20%用于檢驗(yàn)、20%用于測(cè)試[22]。其中隱含層神經(jīng)元數(shù)目使用經(jīng)驗(yàn)公式（1）計(jì)算得到，其中m為隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)，n為輸入層神經(jīng)元個(gè)數(shù)，l為輸出層神經(jīng)元個(gè)數(shù)，a為[1,10]的常數(shù)。

1.2.5 遺傳算法（GA）優(yōu)化最佳工藝參數(shù) 將遺傳算法與ANN構(gòu)建的模型結(jié)合，進(jìn)行全面仿真實(shí)驗(yàn)，以尋求豆渣酶解工藝的最佳工藝參數(shù)組合及最大的還原糖生成量的值。設(shè)定種群大小為50，最大遺傳代數(shù)150，代溝0.9，交叉概率為0.5，變異概率為0.05，運(yùn)行matlab軟件程序，得到每代種群適應(yīng)度及其變化結(jié)果。

1.2.6 酶解動(dòng)力學(xué) 假設(shè)酶解反應(yīng)速率與時(shí)間呈一種冪函數(shù)關(guān)系，同時(shí)將纖維素酶水解看成擬態(tài)一級(jí)反應(yīng),則酶解動(dòng)力學(xué)可以表示為[23?25]：

其中酶解速率常數(shù)為：

式中：S0為初始濃度，g/kg；t為酶解時(shí)間；K0為與時(shí)間無關(guān)的常數(shù)；h為分形維數(shù)，描述底物顆粒不規(guī)則程度的參數(shù)；0.9為木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原糖的系數(shù)。

1.3 還原糖含量測(cè)定及生成量計(jì)算

按照3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[26]。在6支試管中分別加入1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，補(bǔ)蒸餾水至0.5 mL，然后加入DNS試劑1.5 mL，充分混勻。置沸水浴中煮沸5 min，然后迅速流水冷卻，并分別向試管中加入4 mL蒸餾水，混勻。在540 nm處讀OD值。以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性回歸方程。吸取0.5 mL樣品液，按照上述步驟操作測(cè)定OD值，并代入回歸方程中計(jì)算樣品中的還原糖含量。

式中：M0為豆渣中初始還原糖濃度，g/kg；M1為酶解反應(yīng)完成后豆渣中的還原糖濃度，g/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert V 8.0.6、IBM SPSS Statistics22.0、Excel 2017、Origin 2018進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，Matlab 2016a軟件實(shí)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法。且每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性擬合方程為y=0.551x?0.0027（R2=0.9983）（圖1）。結(jié)果顯示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0～0.5 mg/mL內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系較好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2A知，當(dāng)豆渣液p H為4.5～5.1時(shí)，豆渣酶解效果隨溶液p H的增大而增強(qiáng)；pH為5.1時(shí)，豆渣酶解效果最佳；當(dāng)pH為5.1～6.0時(shí)，豆渣酶解效果逐漸減弱。p H會(huì)影響酶分子上酸性和堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)和底物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合[27?28]。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single-factor experimental results

纖維素酶使豆渣中的不溶性膳食纖維分子鏈被切斷，分子量降低，一部分不溶性膳食纖維變成水溶性膳食纖維，然后被水解成還原糖。由圖2B知，隨著纖維素酶添加量的增加，酶與底物的接觸機(jī)率增大，從而加速了反應(yīng)進(jìn)程[29]；纖維素酶添加量達(dá)到4%后，還原糖生成量的增加趨勢(shì)趨于平緩，無顯著差異（P>0.05）。這可能是因?yàn)殡S著酶解產(chǎn)物的增加，產(chǎn)物與酶結(jié)合，阻礙了底物與酶的結(jié)合，減緩了酶解反應(yīng)進(jìn)程[30?31]。出于實(shí)驗(yàn)成本考慮，選擇纖維素酶添加量4%為最適添加量。

由圖2C知，隨著酶解溫度的升高，豆渣酶解效果逐漸加強(qiáng)，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50℃時(shí)，酶解效果達(dá)到最佳，繼續(xù)升高酶解溫度，酶解效果顯著減弱（P<0.05）。這是因?yàn)槊冈诘陀谧钸m溫度時(shí)，升溫會(huì)使反應(yīng)體系內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)加快，提高底物與酶的接觸幾率，但在最適溫度后，維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵就會(huì)隨著溫度的升高開始斷裂，酶反應(yīng)速率降低[32]。

由圖2D知，當(dāng)酶解時(shí)間1.0～3.0 h時(shí)，還原糖生成量隨著酶解時(shí)間的延長而明顯增多，酶解時(shí)間在達(dá)到3 h以后，還原糖生成量變化不顯著（P>0.05），可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長，酶作用越充分，豆渣濃度降低、部分酶逐漸失活以及酶解產(chǎn)物的反饋抑制作用增強(qiáng)，從而影響酶解反應(yīng)的進(jìn)行[33]。因而選擇酶解時(shí)間3 h為最適反應(yīng)時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。以還原糖生成量為響應(yīng)值，利用Design Expert V 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到關(guān)于還原糖生成量與各個(gè)因素的回歸方程的預(yù)測(cè)模型：Y=+2.42?0.4A+0.20B+0.1C+0.049D?0.045AB+0.068AC?0.045AD?0.14BC?0.007BD?0.035CD?0.18A2?0.21B2?0.14C2?0.23D2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the response surface experiment

2.3.2 方差分析 以還原糖生成量為響應(yīng)值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，還原糖生成量回歸模型差異極顯著P<0.0001，失擬值0.3641（P>0.05），表現(xiàn)為不顯著，說明試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值的誤差較小。決定系數(shù)R2=0.9580，因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，回歸方程擬合度較高。模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.9161，表明有8.39%的情況不能對(duì)該模型進(jìn)行解釋。在對(duì)還原糖生成量的影響上，A、B、C、A2、B2、C2和D2均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），BC達(dá)到顯著水平（P<0.05），其中D、AB、AC、AD、BD和CD均為不顯著因素（P>0.05）。由F檢驗(yàn)可以看出A、B、C、D四個(gè)因素對(duì)還原糖生成量的影響為A>B>C>D，即p H>纖維素酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.3.3 交互作用分析 響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[34]，等高線的形狀反映兩因素之間交互作用的顯著程度[35?36]]。由交互作用可知，纖維素酶添加量（B）與酶解溫度（C）對(duì)還原糖生成量的影響顯著（P<0.05，見圖3），p H（A）與纖維素酶添加量（B）、p H（A）與酶解溫度（C）、pH（A）與酶解時(shí)間（D）、纖維素酶添加量（B）與酶解時(shí)間（D）、酶解溫度（C）與酶解時(shí)間（D）的交互項(xiàng)對(duì)還原糖生成量的影響均不顯著（P>0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

圖3 各因素交互作用對(duì)還原糖生成量的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surfaceof the interaction of variousfactorsto the reduction of sugar production

2.3.4 RSM最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 豆渣酶解工藝經(jīng)Design Expert.V 8.0.6軟件分析得出最佳參數(shù)為：p H4.83、纖維素酶添加量為4.33%、酶解溫度為51.60℃和酶解時(shí)間3.09 h，在此條件下還原糖生成量為2.68 g/kg。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際調(diào)整確定最佳工藝參數(shù)為pH4.8、纖維素酶添加量4.3%、酶解溫度52℃、酶解時(shí)間3.1 h，在此條件下進(jìn)行豆渣酶解工藝優(yōu)化的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），得到RSM實(shí)際還原糖生成量為2.54 g/kg。

2.4 ANN模型的建立與訓(xùn)練

由公式（1）與其實(shí)際意義得隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)取值范圍為[3,13]，設(shè)定ANN訓(xùn)練學(xué)習(xí)次數(shù)10000次，學(xué)習(xí)速率為0.35，動(dòng)量常數(shù)為0.54，訓(xùn)練步長100，直至目標(biāo)誤差達(dá)到0.00001時(shí)訓(xùn)練結(jié)束，尋找到測(cè)試集MSE的最小值，得到隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為9。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練出的模型，其擬合回歸系數(shù)R值表示目標(biāo)數(shù)據(jù)和輸出結(jié)果的相關(guān)程度。由圖4可知，訓(xùn)練、驗(yàn)證、測(cè)試、與全數(shù)據(jù)圖中r值分別為0.99451、0.99413、0.99374、0.99432，在現(xiàn)有設(shè)置的參數(shù)下，模型擬合結(jié)果具備優(yōu)良的隨機(jī)驗(yàn)證效果。r預(yù)測(cè)>0.90，說明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型不存在欠擬合狀態(tài)；因此，可認(rèn)為該模型具有較強(qiáng)的解釋能力和較低的仿真誤差，能較好地訓(xùn)練、預(yù)測(cè)和整體擬合效果。

圖4 訓(xùn)練模型適配Fig.4 Training model fit

2.5 GA尋優(yōu)及驗(yàn)證豆渣酶解工藝結(jié)果

通過ANN模型調(diào)試函數(shù)的適應(yīng)度，以還原糖生成量作為其函數(shù)的輸出值，將ANN與GA結(jié)合對(duì)酶解工藝進(jìn)行尋優(yōu)，獲取最佳的豆渣酶解工藝。

由圖5可得，當(dāng)進(jìn)化代數(shù)增大至46代時(shí)，GA停止選擇并得出適應(yīng)度值最高的個(gè)體。運(yùn)行出的優(yōu)化結(jié)果：最優(yōu)工藝參數(shù)為pH5.22、纖維素酶添加量4.38%、酶解溫度51.91℃、酶解時(shí)間3.19 h，還原糖生成量預(yù)測(cè)最大值為2.67 g/kg?？紤]實(shí)際操作，將工藝修改為p H5.2、纖維素酶添加量4.4%、酶解溫度52℃、酶解時(shí)間3.2 h，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），得還原糖生成量值為2.65 g/kg。

圖5 適應(yīng)度曲線Fig.5 Adaptability curve

2.6 RSM和GA-ANN預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比

RSM和GA-ANN模型預(yù)測(cè)的還原糖生成量見表4。使用Excel對(duì)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值作圖（見圖6），分別計(jì)算RSM和GA-ANN的決定系數(shù)R2、RSS與RMSE[37?39]]，為0.9583、0.1434、0.0703和0.9825、0.0353、0.0349，R2、RSS越高，RMSE越小，模型越穩(wěn)健、預(yù)測(cè)效果越好；由表4可知，GA-ANN優(yōu)化結(jié)果比RSM優(yōu)化結(jié)果高，表明使用GA-ANN優(yōu)化豆渣酶解工藝是可行的，GA-ANN模型比RSM的擬合度高、估計(jì)預(yù)測(cè)能力也相對(duì)精準(zhǔn)。

圖6 模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值對(duì)比Fig.6 Compared of model predicted value and actual value

表4 RSM與GA-ANN優(yōu)化結(jié)果比較Table 4 Comparison of RSM with GA-ANN optimization results

2.7 豆渣酶解動(dòng)力學(xué)

用類分形動(dòng)力學(xué)方程式對(duì)豆渣酶解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一元回歸擬合，得擬合曲線如圖7和動(dòng)力學(xué)參數(shù)k0為0.5372、分形維數(shù)h為0.1530，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與方程擬合度達(dá)到0.9827，擬合效果良好。酶解速率常數(shù)反應(yīng)過程的快慢，根據(jù)所得動(dòng)力學(xué)參數(shù)k0與分形維數(shù)h，可得酶解速率常數(shù)隨時(shí)間變化的曲線，見圖8，由于酶的活性、底物與生成物含量變化等因素影響，酶解反應(yīng)速率隨著酶解時(shí)間的增加而不斷降低。

圖7 酶解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 Enzymatic dynamicscurve

圖8 酶解速率常數(shù)曲線Fig.8 Enzyme rate constant curve

3 結(jié)論

本研究通過RSM與GA-ANN兩種方法優(yōu)化出豆渣酶解生成還原糖的最佳工藝為p H5.2，纖維素酶添加量4.4%，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間3.2 h，此條件下還原糖生成量為2.65 g/kg。通過類分形動(dòng)力學(xué)建立了豆渣的酶解動(dòng)力學(xué)模型，該模型的R2達(dá)到0.9827，擬合效果良好。本實(shí)驗(yàn)為豆渣的高效利用和后期全豆豆腐研究提供了理論支撐，但豆渣酶解生成的還原糖組分及其在全豆豆腐中的作用機(jī)制不明，還有待進(jìn)一步分析研究。