柑橘皮蛋白質提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

徐 弦，安兆祥，李曉明，劉馥源，程宏楨，沈勇根，蔡志鵬

（江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，江西省發(fā)展與改革委員會農產品加工與安全控制工程實驗室，江西南昌 330045）

柑橘屬蕓香科下屬植物，是世界上第一大水果[1?2]。近年來，無論是產量還是栽培面積均居世界各類水果首位[3]。柑橘類水果作為新鮮農產品，果汁在世界范圍內被大量消費，而果皮通常被當作廢物丟棄[4]。目前世界上對柑橘的加工能力占35%，而我國卻只有5%[5]?，F在大部分柑橘皮渣會用作生產加工動物飼料或者被棄用填埋，而進行填埋處理容易導致霉變發(fā)臭直接對環(huán)境造成污染[6]。所以，對“無用”的柑橘皮進行進一步加工處理，不僅可以增加柑橘產業(yè)的附加值，還可以減輕環(huán)境壓力。

柑橘皮渣是工廠對柑橘加工處理后以及榨成汁后的剩余物，重量約占柑橘總重量的30%，其內營養(yǎng)豐富，蛋白質含量約占7.7%（干重），還含有如鈣、磷、鉀、鎂、鐵、銅，鋅、硒、碘等各種礦物質元素[7]。柑橘皮在中國最早應用于中藥，人們通常將柑橘皮曬干當作陳皮入藥，具有健脾開胃、理氣消食、清熱解毒等多種益處。我國柑橘加工產業(yè)發(fā)展迅速，柑橘皮渣資源十分豐富，但是中藥所需數量有限且由于缺乏相關研究和技術落后，導致很多柑橘皮渣無法得到有效的利用而直接廢棄[8]。近年來，隨著人民生活質量水平的提高，人們對食品營養(yǎng)健康的需求也越來越高。相對于動物蛋白，植物蛋白資源更加豐富，因其價格便宜，且不含膽固醇以及飽和脂肪，能夠降低人體血壓，而越來越被人們所關注[9?10]。目前人們對于柑橘皮的研究主要集中在香精油[11?13]、果膠[14?16]的提取與利用，對其蛋白質的提取與開發(fā)利用卻相對較少。

蛋白質提取的方法有很多，常用的有水溶液提取、堿溶酸沉[17]、有機溶劑提取、酶法提取等。其中堿溶酸沉法操作簡單、綜合成本較低、提取率也相對可觀，因此大部分蛋白質的提取都會選擇此法[18]。所以，本文采用堿提酸沉法來作為提取柑橘皮蛋白質的方法，通過單因素實驗與Box-Benhnken設計結合，確定提取柑橘皮蛋白質的最佳工藝，并對提取的柑橘皮蛋白質進行體外抗氧化活性評價，為柑橘皮蛋白質日后開發(fā)與利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮贛南臍橙 江西農大超市；牛血清蛋白（BSA）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼） 上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸 四川西隴化工有限公司；NaOH 天津永大化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250 上海強順化學試劑有限公司；抗壞血酸 上海展云化工有限公司；亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸 上海麥克林生化科技有限公司；雙氧水、硫酸亞鐵、PBS、水楊酸、無水乙醇 南昌市蕪錦生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

WFJ 2100可見分光光度計 尤尼科（上海）科學儀器有限公司；DHG-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SCZL-2數顯控溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；Q500B高速多功能粉碎機 上海冰都電器有限公司；100目標準篩 紹興市上虞張興紗篩廠；PHS-P便攜式p H計 上海大普儀器有限公司；K-355凱氏定氮儀瑞士步琪有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SF-TGL-16G臺式高速離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；T-25 basic高速分散機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；QL-901渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ME3002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 取新鮮柑橘皮置于50℃鼓風干燥箱中4 h至烘干，然后用高速多功能粉碎機粉碎后過100目篩，得到柑橘皮粉，保存至真空干燥皿備用。

1.2.2 牛血清蛋白標準曲線的繪制 分別配制濃度為（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）的牛血清蛋白質溶液。分別吸取1 mL不同濃度的蛋白質溶液于10 mL離心管中，再向離心管中加入5 mL考馬斯亮藍，振蕩混勻，靜置2 min。在波長為595 nm處用分光光度計測定不同濃度的牛血清蛋白質吸光度值，以蛋白質標準溶液濃度為橫坐標（mg/mL），對應的吸光度值為縱坐標，繪制牛血清蛋白質的標準曲線。

1.2.3 柑橘皮蛋白質等電點（pI）的測定 參照孫小斐等[19]的方法對柑橘皮蛋白質的等電點進行測定。先用量筒量取10 mL柑橘皮提取液溶液，加鹽酸分別將溶液p H調為2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4，于4℃恒溫箱靜置沉淀24 h。將溶液以10000 r/min離心15 min，除去沉淀，保留上清液，取1 mL上清液于10 mL離心管中，再向離心管中加入5 mL考馬斯亮藍溶液，振蕩混勻，靜置2 min。在波長為595 nm處使用可見光分光光度計分別測定不同pH上清液其吸光度值。當吸光度值為最小時，此時溶液的pH即為柑橘皮蛋白質等電點。

1.2.4 柑橘皮蛋白質提取 柑橘皮蛋白質的提取方式參照劉靜等[20]的方法并作相應的修改。取1 g柑橘皮粉，按相應料液比（1:20～1:50）g/mL加入蒸餾水在燒杯中溶解，用0.1 mol/L NaOH將柑橘皮溶液調至相應堿溶pH（9～13），邊攪拌邊恒溫（30～70℃）加熱（0.5～3 h），常溫下冷卻后離心15 min（6000 r/min，4℃），取1 mL上清液，采用Bradford法測上清液蛋白含量，用0.1 mol/L HCl將剩余上清液pH調至等電點，在4℃條件下沉淀24 h，離心15 min（10000 r/min，4℃），取沉淀水洗并用0.1 mol/L NaOH調至中性（p H≈7），用真空冷凍干燥機干燥48 h得到柑橘皮蛋白質粉。

1.2.5 柑橘皮蛋白提取率的測定 采用Bradford[21]的方法對溶液中的蛋白質進行定量，吸取0.30 mL蛋白質提取液于10 mL離心管中，再加入0.70 mL的蒸餾水和5 mL的考馬斯亮藍溶液，振蕩混勻，靜置2 min。于波長為595 nm處測定柑橘皮蛋白質提取液的吸光度值，再結合牛血清蛋白質標準曲線計算提取液中蛋白質的含量。根據凱氏定氮法測定柑橘皮中蛋白質的總含量。根據公式（1）計算柑橘皮蛋白質提取率：

1.2.6 單因素實驗 柑橘皮蛋白提取工藝中，先固定提取工藝條件：p H為10、提取溫度為50℃、提取時間為2 h、料液比為1:30（g/mL）。每次單因素實驗取1 g柑橘皮粉末，分別考察pH（9、10、11、12、13）、提取溫度（30、40、50、60、70℃）、料液比（1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50 g/mL）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）等4個因素對柑橘皮蛋白質提取率的影響，選擇p H、提取溫度、提取時間、料液比最優(yōu)的水平進行后續(xù)的響應面試驗。

1.2.7 響應面優(yōu)化設計 在前節(jié)1.2.6單因素實驗的基礎上，運用軟件Design-Expert 8.0.6中的響應面優(yōu)化設計，以pH（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、料液比（D）這四個單因素為自變量，以實驗中柑橘皮蛋白質提取率的大小為響應面的響應值進行工藝條件優(yōu)化，相關試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面因素水平編碼Table 1 Factor level coding of response surface

1.2.8 柑橘皮蛋白質純度計算 將優(yōu)化工藝條件下提取的柑橘皮蛋白質粗提液調至等電點，過濾取沉淀，冷凍干燥，得到柑橘皮粗蛋白，取0.2 g蛋白質粗提物，用蒸餾水定容至50 mL作為待測液，取1 mL待測液按照1.2.5中的方法測定溶液中柑橘皮蛋白質含量，柑橘皮蛋白質純度按照公式（2）計算：

式中：M1為溶液中柑橘皮蛋白質的質量；M2為樣品粗提物質量。

1.2.9 體外抗氧化活性測定 通過測定柑橘皮蛋白質溶液對DPPH·、H2O2、·OH和N O?2的清除率來研究其體外抗氧化活性的能力。

1.2.9.1 清除DPPH·活性測定 參照Hou等[22]方法并做修改。先分別量取2 mL不同質量濃度的柑橘皮蛋白質溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于10 mL離心管中，加入剛配制的0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL，振蕩混勻，在25℃環(huán)境下避光保存30 min，然后使用可見光分光度計測定其在波長為517 nm處的吸光度值，計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水代替蛋白質溶液吸光度值；A1為樣品蛋白質溶液實驗的吸光度值；A2為無水乙醇代替DPPH·的吸光度值。

1.2.9.2 清除H2O2活性測定 參照Liu等[23]方法并做修改。先分別量取2 mL不同質量濃度柑橘皮蛋白質溶液（0.2～1.0 mg/mL）于10 mL離心管中，再分別加入4.8 mL 0.1 mmol/L PBS（pH7.4）和1.2 mL 40 mmol/L H2O2溶液，振蕩混勻，在25℃環(huán)境下放置30 min，然后使用可見光分光光度計測定其在波長為230 nm處的光度值，計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水代替蛋白質溶液所測的吸光度值；A1為樣品蛋白質溶液實驗的吸光度值；A2為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度值。

1.2.9.3 清除·OH活性測定 參照周明等[24]的方法并做修改。先分別量取2 mL不同質量濃度（0.2～1.0 mg/mL）的柑橘皮蛋白質溶液于10 mL離心管中，再往離心管中加入剛配制好的2 mL 6 mmoL/L的雙氧水溶液和2 mL 6 mmoL/L的硫酸亞鐵溶液，將離心管中混合液完全混勻后在避光處靜置30 min，再向離心管中加入剛配制好的2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，振蕩混勻，25℃環(huán)境下靜置10 min，然后使用可見光分光光度計測定其在波長為510 nm處的吸光度值，計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水代替蛋白質溶液的吸光度值；A1為樣品蛋白質溶液實驗的吸光度值；A2為蒸餾水代替水楊酸溶液的吸光度值。

1.2.9.4 清除N O?2活性測定 參照趙功玲等[25]的方法并做修改。先分別量取1 mL不同質量濃度（0.2～1.0 mg/mL）的柑橘皮蛋白溶液于10 mL離心管中，再加入1 mL 0.2%亞硝酸鈉標準使用液，振蕩混勻，在37℃恒溫水浴鍋內加熱20 min，再往試管中加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，振蕩混勻，靜置10 min，再向離心管中的混合溶液中加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，在避光處充分反應15 min，然后使用可見光分光光度計測定其在波長為538 nm處的吸光度值，計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水代替蛋白質溶液的吸光度值；A1為樣品蛋白質溶液實驗的吸光度值。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計；使用OriginPro9.1和IBM SPSS Statistics 22進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 牛血清蛋白質標準曲線

根據試驗數據，以牛血清蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標用Excel 2010繪制標準曲線，得到回歸方程y=4.685x+0.0813，R2=0.9991，ODck=0.410。牛血清蛋白與標準品與吸光度值呈良好的線性關系如圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum protein

2.2 柑橘皮蛋白質等電點

如圖2所示，當pH為3.0附近時，上清液的吸光度值為最低，曲線為最低點，說明此時溶液中蛋白質含量最低。當蛋白質處于等電點時，蛋白質分子所帶的正電荷與負電荷恰好相等，相同電荷間作用力抵消，其顆粒極易發(fā)生碰撞而產生沉淀，導致蛋白質容易析出。所以pH3.0為柑橘皮蛋白質等電點。將蛋白質提取液的pH調至等電點，溶液中的蛋白質將以沉淀的形式從溶液中析出，過濾得到蛋白質沉淀，經過冷凍干燥得到柑橘皮粗蛋白質。

圖2 柑橘皮蛋白質等電點Fig.2 Isoelectric point of citrus peel protein

2.3 單因素實驗

2.3.1 pH對柑橘皮蛋白提取率的影響 如圖3所示，隨著p H的逐漸升高，溶液中柑橘皮蛋白質的提取率先上升后下降。當溶液p H處于9～12時，柑橘皮蛋白質的提取率隨著p H的升高而顯著上升（P<0.05），這可能是由于p H在一定堿性范圍內，p H越高，溶液中蛋白質分子間的氫鍵越容易被打破[26]，隨著氫鍵被打破，蛋白質分子間的相互作用力減小，會加強蛋白質分子與水分子的結合，增加其與水的溶解度；當pH=12時，柑橘皮蛋白質提取率達到55.20%；當溶液p H>12時，柑橘皮蛋白質的提取率下降顯著（P<0.05），這可能是因為強堿導致溶液較為濃稠，不易使蛋白質從柑橘皮中溶出，且p H過高容易使蛋白質變性。所以選取pH=12進行后續(xù)響應面試驗。

圖3 pH對柑橘皮蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of protein from citrus peel

2.3.2 提取溫度對柑橘皮蛋白提取率的影響 如圖4所示，隨著提取溫度的逐漸升高，柑橘皮蛋白質的提取率是先升高后下降。當溶液提取溫度處于30～60℃時，柑橘皮蛋白質的提取率隨著提取溫度的升高而顯著上升（P<0.05），提取液溫度的升高會增加溶液中分子的動能和擴散速率，導致氮溶解指數升高，從而增加了蛋白質的溶出；當提取溫度為60℃時，柑橘皮蛋白質提取率達到峰值53.43%；而隨著提取溫度繼續(xù)升高時，柑橘皮蛋白質提取率下降顯著（P<0.05），這可能是當溫度超過60℃時，柑橘皮蛋白質已經開始變性，氮溶解指數開始下降。所以選擇最適溫度60℃進行后續(xù)的響應面試驗。

圖4 提取溫度對柑橘皮蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of protein from citrus peel

2.3.3 料液比對蛋白提取率的影響 如圖5所示，隨著料液比的升高，蛋白質的提取率先上升后趨于平緩。當溶液料液比為1:20～1:45（g/mL）之間時，柑橘皮蛋白質提取率隨著料液比的升高而顯著上升（P<0.05），當料液比較低時柑橘皮沒有完全溶解，溶液較為粘稠，不利于蛋白質從柑橘皮中溶出，所以在這個范圍內，隨著料液比的增加，柑橘皮蛋白質提取率越來越高。而隨著料液比繼續(xù)增加時，蛋白質提取率略微下降，但下降趨勢較為平緩，此時柑橘皮溶解已達到最大，所以蛋白質提取率變化不大，但是過高的料液比會導致酸沉時產生大量的廢料，成本增多，所以選擇料液比為1:45（g/mL）進行后續(xù)響應面試驗。

圖5 料液比對柑橘皮蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein from citrus peel

2.3.4 提取時間對蛋白質提取率的影響 如圖6所示，隨著提取時間的逐漸增加，柑橘皮蛋白質的提取率呈先上升后下降的倒“V”型。當提取時間處于0.5～2.5 h之間時，柑橘皮蛋白質的提取率隨著提取時間的升高顯著上升（P<0.05），這可能是當提取溫度在這個范圍內，提取時間越長，越有利于柑橘皮蛋白質的溶解；而隨著提取時間繼續(xù)增加時，柑橘皮蛋白質提取率下降顯著（P<0.05），這可能是由于當蛋白質長時間處于堿溶液時部分蛋白質會出現聚集現象而產生沉淀，而與雜質一起被離心分離。所以選取2.5 h進行后續(xù)的響應面試驗。

圖6 提取時間對柑橘皮蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of protein from citrus peel

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應面設計及結果 以pH（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、料液比（D）4個單因素為自變量，以柑橘皮蛋白質提取率的大小為響應面的響應值，利用Box-Behnken一共設計出29組試驗，相應的響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.4.2 響應面模型的建立與分析 根據Design-Expert 8.0.6對響應面模型結果進行擬合分析，以pH、提取溫度、提取時間、料液比四個因素為自變量，以柑橘皮蛋白質提取率為響應面響應值的二元回歸方程：Y=60.46+6.55A+4.31B?1.43C+0.10D?2.31AB+0.97AC?0.79AD?0.23BC?3.05BD?0.85CD?11.99A2?5.99B2?4.19C2?4.47D2。

由表3可知，模型中一次項A（pH）、B（提取溫度）、C（提取時間）對柑橘皮蛋白質提取率影響極顯著（P<0.01），D（料液比）對柑橘皮蛋白質提取率影響不顯著（P>0.05）；模型中AD、CD對蛋白質提取率影響顯著（P<0.05），BC對蛋白質提取率影響不顯著（P>0.05），其余都是極顯著（P<0.01），這說明了各因素對柑橘皮蛋白質提取率的影響并不只是簡單的線性關系。此外，該模型中P<0.0001、F值為382.54、失擬項P=0.3104（>0.05），該響應面模型差異極顯著，模型失擬項不顯著，說明實驗方法與設計可靠、合理，且其他未知因素對該實驗結果影響較??；其中模型決定系數R2=0.9974，校正系數R2Adj=0.9948，這說明模擬預測值與真實試驗值在試驗范圍內模擬度非常好。所以，回歸方程可以用來分析與預測柑橘皮蛋白質提取的工藝結果。根據F值得大小可知，影響柑橘皮蛋白質提取率因素的主次順序為：pH>提取溫度>提取時間>料液比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

2.4.3 響應面各因素相互作用分析 響應面曲面的凹凸程度反映了各因素對柑橘皮蛋白質提取率的影響大小。當一個響應曲面曲率越大時，說明響應值對于因素大小的變化十分敏感；當響應面曲率較小時，說明響應值對因素大小的變化不敏感[27]。如圖7a～圖7c所示，三個曲面的曲率相對較大，其中p H與提取溫度的交互作用大于p H與提取時間和p H與料液比的交互作用對響應值的影響，其中p H的變化對柑橘皮蛋白質提取率影響最大。再結合圖7d～圖7f曲率可知，提取溫度、提取時間、料液比兩兩之間的交互作用對響應值的影響相對較小，提取率對提取溫度改變的敏感程度大于提取時間，提取率對料液比改變的敏感程度最低。因此4個因素對柑橘皮蛋白質提取率影響次序為：pH>提取溫度>提取時間>料液比，與方差分析結果一致。

圖7 各因素交互對柑橘皮蛋白提取率的影響的響應面圖Fig.7 Responsesurface methodology for theeffect of interaction of variousfactorson the extraction rateof citrus peel protein

2.4.4 最佳工藝驗證試驗 利用Desig-Expert8.0.6軟件優(yōu)化回歸模型進行的工藝參數，確定提取柑橘皮蛋白質的最適工藝條件為p H為12.12，提取溫度為52.8℃，提取時間2.59 h，料液比1:42.1（g/mL），預測蛋白質提取率為63.01%。為證明響應面優(yōu)化設計的合理與可靠性，進行試驗驗證，考慮到實際操作的可行性，將工藝條件修改為：pH為12.1，提取溫度為52.8℃，提取時間2.6 h，料液比1:42（g/mL）。進行三次驗證試驗，得到的蛋白提取率為62.23%±0.22%。這與模型預測值的相對偏差為1.2%，說明該提取條件參數可靠，具有較好的可行性。經計算，最優(yōu)條件下提取的蛋白質純度為42.3%。

2.5 柑橘皮蛋白質抗氧化活性

2.5.1 DPPH·清除能力測定 DPPH·溶液為紫色，會與抗氧化物質發(fā)生還原反應導致溶液褪色，并且在517 nm處存在最大吸收峰，根據吸收值的變化來判斷物質的抗氧化能力強弱[28]。如圖8所示，在濃度為1～5 mg/mL范圍內，VC對DPPH·的清除率穩(wěn)定在93%～94%之間，各濃度之間差異不顯著（P>0.05）；在濃度為1～3 mg/mL范圍內，柑橘皮蛋白質對DPPH·清除率隨著濃度的增加而顯著上升（P<0.05），當濃度處于3～5 mg/mL范圍時，柑橘皮蛋白質對DPPH·清除率趨于穩(wěn)定，各濃度間差異不顯著（P>0.05），其清除率最高可達87.5%，經數據分析，柑橘皮蛋白質對DPPH·的IC50為1.20312 mg/mL，其IC50小于10 mg/mL，說明柑橘皮蛋白質具有較好的抗氧化效果[29]。VC對DPPH·的IC50明顯小于柑橘皮蛋白質，所以，柑橘皮蛋白質對DPPH·清除效果小于VC。

圖8 柑橘皮蛋白質和VC對DPPH·清除率Fig.8 Scavenging effect of VC and citrus peel protein on DPPH· radical

2.5.2 H2O2清除能力測定 由圖9可知，在濃度為0.2～1.0 mg/mL范圍內，柑橘皮蛋白質對H2O2的清除率隨著濃度的增加而顯著上升（P<0.05），在濃度為1.0～1.2 mg/mL時，柑橘皮蛋白質對H2O2清除率趨于穩(wěn)定，各濃度間差異不顯著（P>0.05），最高清除率可達79.3%；在濃度為0.2～1.0 mg/mL，VC對H2O2的清除率顯著上升（P<0.05），當濃度超過0.4 mg/mL時，VC對H2O2清除率趨于穩(wěn)定，各濃度間差異不顯著（P>0.05），最高清除率可達92.8%；經數據分析，柑橘皮蛋白質清除H2O2的IC50為0.52516 mg/mL，VC對H2O2的IC50小于柑橘皮蛋白質對H2O2的IC50，所以，VC對H2O2的清除效果好于柑橘皮蛋白質。

圖9 柑橘皮蛋白質和VC對H2O2清除率Fig.9 Scavenging effect of VC and citruspeel protein on H2O2 radical

2.5.3 ·OH清除能力測定 ·OH是一種對人體毒害很大的自由基，它能與人體內的蛋白質、DNA等物質發(fā)生氧化反應，導致人體細胞受損或壞死[30]。由圖10可知，在濃度為0.2～1.0 mg/mL范圍內，隨著濃度的增大，柑橘皮蛋白質和VC對·OH的清除率均顯著上升（P<0.05），在濃度為0.2 mg/mL時，柑橘皮蛋白質對·OH清除率略大于VC，當濃度為1.0～1.2 mg/mL范圍內，柑橘皮蛋白質與VC對·OH的清除率趨于穩(wěn)定，各濃度間差異不顯著（P>0.05）；其中VC對·OH的IC50為0.48629 mg/mL，柑橘皮蛋白質對·OH清除率的IC50為0.79207 mg/mL，據相關文獻報道，曹偉等[31]利用鹽法提取的茶籽蛋白質對·OH的IC50為2 mg/mL，表明其對·OH清除能力小于柑橘皮蛋白質，這可能由于蛋白質提取方法的不同以及不同植物蛋白的結構差異導致的。根據IC50值的大小可以判斷出柑橘皮蛋白質對·OH清除效果小于VC。

圖10 柑橘皮蛋白質和VC對·OH清除率Fig.10 Scavenging effect of VC and citrus peel protein on ·OH radical

2.5.4 N O?2清除能力測定 如圖11可知，在濃度為0.2～1.0 mg/mL范圍內，柑橘皮蛋白質和VC對NO?2的清除率隨著濃度的增加而顯著上升（P<0.05），當柑橘皮蛋白質濃度在1.0～1.4 mg/mL范圍內，柑橘皮蛋白質對于N O?2的清除率趨于穩(wěn)定，各濃度間差異不顯著（P>0.05），清除率最高可達到59.3%；當VC濃度在1.2～1.4 mg/mL范圍內，其對N O?2的清除率趨于穩(wěn)定，變化不顯著（P>0.05），清除率最高可達89.8%；經數據分析，柑橘皮蛋白質對N O?2的IC50為0.87216 mg/mL，VC對N O?2的IC50為0.47847 mg/mL，根據IC50值可以判斷柑橘皮蛋白質對N O?2的清除效果小于VC。

圖11 柑橘皮蛋白質和VC對N O?2清除率Fig.11 Scavenging effect of VC and citruspeel protein on N O?2 radical

3 結論

本實驗采用堿法提取柑橘皮蛋白質，并結合響應面優(yōu)化設計得到柑橘皮蛋白提取的最佳工藝，確定了最佳提取工藝：p H為12.1，提取溫度為52.8℃，提取時間2.6 h，料液比1:42（g/mL），在此條件下進行三次核對檢驗試驗，最后得到柑橘皮蛋白質提取率為62.23%±0.22%，與預測值63.01%接近。說明該模型對試驗擬合程度較高，工藝合理可靠；柑橘皮蛋白質對對DPPH·、H2O2、·OH、和N O?2清除率的IC50值分別為1.20312、0.52516、0.79207、0.87216 mg/mL，其值均小于10 mg/mL，表明柑橘皮蛋白質具有較好的體外抗氧化活性，但其抗氧化活性均小于VC。該實驗結果可為廢棄柑橘皮提供新的資源化利用途徑，且柑橘皮蛋白質可以作為新的抗氧化食品應用。

雖然柑橘皮蛋白質在體外表現出較好的抗氧化活性，但是其具體發(fā)揮抗氧化作用的機制以及在體內是否還能保持這樣的作用還需要進一步研究。