雙菌種混合發(fā)酵制備富含γ-氨基丁酸酸奶工藝優(yōu)化

孫世鑫，李 科，駱鵬飛，俞蘭秀，莫小葉，孫海燕，劉 冬,

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳 518055；2.綠雪生物工程（深圳）有限公司，廣東深圳 518055）

γ-氨基丁酸又名γ-氨酪酸、4-氨基丁酸，是一種在動植物體內(nèi)廣泛存在的小分子量非蛋白質(zhì)氨基酸。作為哺乳動物重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，GABA在日常代謝和神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著巨大作用：如可通過GABAA受體改變神經(jīng)突觸后膜對Cl-的通透性來發(fā)揮鎮(zhèn)定安神的功效[2]，或通過對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的高效抑制來降低血壓[3]等。2009年9月，我國正式批準(zhǔn)GABA為新資源食品，允許其在除嬰幼兒食品之外的飲料等食品中添加使用，且攝入量不超過500 mg/d[4]。

當(dāng)前，功能性酸奶已經(jīng)成為乳制品開發(fā)的主流。如具備安神助眠功效的酸奶，即可通過直接發(fā)酵法[5]制備。在生產(chǎn)中，向乳液內(nèi)添加在乳基底物中具備較高GABA合成活性的乳酸菌，在發(fā)酵的同時利用其胞內(nèi)的谷氨酸脫羧酶（Glutamate Decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）催化L-谷氨酸或其鈉鹽，經(jīng)GABA支路脫羧合成GABA[6]，即可直接生產(chǎn)出天然富含GABA的功能性酸奶。研究結(jié)果表明，經(jīng)口服攝入的GABA能夠由消化道進(jìn)入血液循環(huán)[7]，發(fā)揮舒緩焦慮[8]、抗解壓力[9]和改善睡眠[10]等保健作用。此外，有研究證實，富含GABA的功能性酸奶在感官指標(biāo)方面與傳統(tǒng)酸奶無顯著差異，且乳酸菌活菌數(shù)和GABA含量在酸奶保質(zhì)期內(nèi)能夠保持相對穩(wěn)定[11]。因此，篩選在乳基底物中具備較高GABA合成活性的乳酸菌并優(yōu)化其GABA生產(chǎn)工藝具備重要的經(jīng)濟(jì)意義。

本研究利用課題組前期從國內(nèi)市售奶酪、奶疙瘩等發(fā)酵食品中篩選得到的在乳基底物中具備高產(chǎn)GABA潛力的乳酸乳球菌乳酸亞種等菌種，以脫脂復(fù)原乳液為主要原料，通過單菌種發(fā)酵及雙菌種發(fā)酵的單因素實驗，確定了菌種在乳基環(huán)境中的最適發(fā)酵條件；利用均勻?qū)嶒灅?gòu)建出雙菌混合發(fā)酵過程的模型方程，確定了優(yōu)化后的混合發(fā)酵工藝參數(shù)，以期為更多富含GABA發(fā)酵乳制品的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GABA高產(chǎn)潛力菌種乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis，菌種編號4043）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus，菌種編號1060）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，菌種編號1134）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，菌種編號1443） 實驗室保藏；培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基、M 17肉湯培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基 實驗室自制；脫脂乳粉市售；四氫呋喃、甲醇、乙腈 色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；L-Glu-Na（生化試劑純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

5810R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendoff公司；LC-20AT型高效液相色譜 日本Shimadzu公司；PHS-3C型p H計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制MRS肉湯培養(yǎng)基和M 17肉湯培養(yǎng)基：蒸餾水混勻后調(diào)節(jié)pH為7.2±0.1，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵乳液：用純水溶解乳粉，配制成10%（w/v）的乳液，按照實驗所需質(zhì)量濃度加入適量L-Glu-Na[12]，混勻后分裝入100 mL錐形瓶，97℃水浴滅菌15 min后冷卻至室溫備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 單菌種最適發(fā)酵溫度的確定 取活化后的4043號菌種子液，按3%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，分別于28、30、34、37、40℃下恒溫發(fā)酵48 h，隨后測定發(fā)酵終點酸奶的酸度、活菌數(shù)、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.2 單菌種最適發(fā)酵時間的確定 取活化后的4043號菌種子液，按3%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，分別于最適發(fā)酵溫度下恒溫發(fā)酵12、24、36、48、60 h，隨后測定發(fā)酵終點酸奶的酸度、活菌數(shù)、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.3 單菌種最適接種量的確定 取活化后的4043號菌種子液，分別按2%、3%、4%、5%、6%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，在最適發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間下恒溫發(fā)酵至終點，隨后測定酸奶的酸度、活菌數(shù)、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.4 單菌種最適L-Glu-Na添加量的確定 取適量L-Glu-Na加入10%（w/v）乳液，分別配制L-Glu-Na質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 g/L的發(fā)酵乳液。取活化后的4043號菌種子液按5%（v/v）的比例轉(zhuǎn)接于上述發(fā)酵乳液中，最適發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間下發(fā)酵至終點，隨后測定酸奶的酸度、活菌數(shù)、pH及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.5 雙菌種復(fù)配方案及最適發(fā)酵溫度的確定將活化后的1443號菌、1060號菌、1134號菌分別與4043號菌的種子液按1:1比例進(jìn)行復(fù)配，并按6%（v/v）的總比接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，分別在34和37℃下恒溫發(fā)酵48 h，隨后測定發(fā)酵終點酸奶的酸度、活菌數(shù)、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.6 雙菌種最適發(fā)酵時間的確定 將活化后的4043號菌和1443號菌種子液按1:1比例進(jìn)行復(fù)配，并按6%（v/v）的總比接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，分別于34℃恒溫發(fā)酵12、24、36、48、60 h，隨后測定發(fā)酵終點酸奶的酸度、活菌數(shù)、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.7 雙菌種最適總接種量的確定 將活化后的4043號菌和1443號菌的種子液按1:1比例進(jìn)行復(fù)配，并分別按4%、6%、8%、10%、12%的總比接種于L-Glu-Na質(zhì)量濃度2 g/L的發(fā)酵乳液中，在34℃下恒溫發(fā)酵48 h，隨后測定發(fā)酵終點酸奶的酸度、活菌數(shù)、pH及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.3 均勻?qū)嶒?根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、L-Glu-Na添加量、球/桿菌配比為影響因素，并設(shè)定適宜水平，進(jìn)行均勻?qū)嶒?。使用DPS 7.05（Data Processing System 7.05）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，制作一個U12（12×63）混合水平均勻設(shè)計表，在錄入因素及水平個數(shù)后，控制最大尋優(yōu)時間為5 min、最大迭代次數(shù)為1000次的優(yōu)化操作，最終得到的混合水平均勻設(shè)計方案（中心化偏差CD=0.1296），如表1所示。

表1 混合水平均勻設(shè)計方案Table 1 Mixed-level uniform design scheme

1.2.4 GABA和L-Glu-Na的定量檢測 使用HPLC法，在QB/T 4587-2013檢測方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。精密吸取適量樣品液與等體積的鄰苯二甲醛衍生劑混合，室溫反應(yīng)2 min后經(jīng)0.22μm尼龍針頭過濾器轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶。流動相A為25 mmol/L醋酸鈉，調(diào)p H至7.2；流動相B為甲醇和乙腈，混合比例為50:50，兩相均經(jīng)0.45μm有機(jī)系濾膜抽濾后超聲脫氣20 min后使用。色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫為40℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，檢測波長334 nm，梯度洗脫（梯度洗脫程序如表2所示）。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

配制10、50、100、150、250μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)工作液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積（y）對GABA濃度（x）做線性回歸，得線性回歸方程y=14179x?59007，線性決定系數(shù)R2=0.9998。

配制10、100、500、1000、1500 μg/mL的L-Glu-Na脫脂乳溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積（y）對LGlu-Na濃度(x)做線性回歸，得線性回歸方程y=5392x+534801，線性決定系數(shù)R2=0.9989。

1.2.5 酸度和p H的測定 酸奶酸度參照國標(biāo)GB 5009.239-2016《食品酸度的測定》，采用乳與乳制品酸度的測定方法。取酸奶樣品10 g于盛有20 mL蒸餾水的燒杯中，滴加適量酚酞混勻后，用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至淡粉色且30 s不褪色，即為滴定終點。記錄消耗的NaOH溶液體積（mL），計算酸度值（°T）。

酸奶pH采用pH計測定。取酸奶樣品10 g于燒杯中，按照1:1添加去離子水混勻，用PHS-3C型p H計測定稀釋后樣品的pH。

1.2.6 乳酸菌活菌數(shù)的測定 參照國標(biāo)GB4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》，采用平板計數(shù)法。取酸奶樣品25 g于盛有225 mL滅菌生理鹽水的燒杯中混勻，后取10 mL于90 mL滅菌生理鹽水試管中混勻，依次操作進(jìn)行10倍稀釋后選取適合的梯度，吸取100μL的樣品勻液涂布于MRS平板培養(yǎng)基，在37℃下厭氧培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)為30～300的平板計數(shù)，以lg CFU/mL表示活菌數(shù)。

1.2.7 感官評定 酸奶由10名食品專業(yè)學(xué)生作為感官鑒評員分別評分，取平均值。感官評分指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010并做適當(dāng)修改，如表3所示。

表3 酸奶感官評分指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation index and standards of yogurt

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗均做3次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD表示。實驗數(shù)據(jù)的差異顯著性用SPSS 22.0軟件中one-way ANOVA法檢驗，P<0.05為有顯著差異，并用GraphPad Prism 8軟件作圖。正交試驗和二次正交旋轉(zhuǎn)組合實驗使用DPS7.05軟件進(jìn)行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌種發(fā)酵單因素實驗結(jié)果

2.1.1 最適發(fā)酵溫度的確定 溫度是影響菌株生長代謝的重要因素。發(fā)酵溫度對單菌種發(fā)酵結(jié)果的影響如圖1所示。由圖1可知，酸奶中GABA產(chǎn)量隨發(fā)酵溫度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢。由于L-Glu-Na是乳酸菌GAD轉(zhuǎn)化合成GABA的底物，故LGlu-Na殘留量即表現(xiàn)為相反的先降后升。比較可見，GABA產(chǎn)量與活菌數(shù)兩者變化趨勢并不同步，究其原因，應(yīng)與溫度對4043號菌種的生長特性及其GAD的酶學(xué)性質(zhì)的影響不同有關(guān)。隨著發(fā)酵溫度升高，酸奶中活菌數(shù)顯著增長，至30℃達(dá)到最高值，表明30℃為4043號菌種的最適生長溫度。隨著溫度繼續(xù)升高，4043號菌種的生長受到抑制，導(dǎo)致活菌數(shù)迅速下降。而有研究顯示，乳酸菌GAD的最適反應(yīng)溫度分布在30～50℃區(qū)間[5]，在40℃左右活力最高[13]。因此在30～40℃范圍內(nèi)，4043號菌種的GAD活力應(yīng)隨溫度升高而持續(xù)增強。當(dāng)發(fā)酵溫度在30～34℃范圍，活菌數(shù)開始減少，GAD活力的增強抵消了GAD總量減少的消極影響，使L-Glu-Na的轉(zhuǎn)化效率在總體上提升，GABA產(chǎn)量繼續(xù)增加。但隨著溫度升高，活菌數(shù)進(jìn)一步減少，使GAD總量顯著降低，即便活力進(jìn)一步增強也無法提升轉(zhuǎn)化速率，導(dǎo)致GABA產(chǎn)量開始下降。4043號菌種GABA產(chǎn)量隨溫度升高先升后降的現(xiàn)象與干酪乳桿菌NFRI7415的GABA產(chǎn)量在37～43℃發(fā)酵溫度區(qū)間內(nèi)的變化[14]類似。因此，當(dāng)發(fā)酵溫度為34℃時，GABA產(chǎn)量即為最高值，約0.52±0.02 g/L。此外，研究顯示，L-Glu-Na在清水中的呈鮮閾值為0.30 g/L[15]，在酸奶中的呈鮮閾值約為0.13 g/L[16]。若L-Glu-Na殘留量高于0.13 g/L，則酸奶會呈現(xiàn)出較為明顯的咸、鮮等味道，不利于保持酸奶的良好風(fēng)味，因此應(yīng)盡量減少發(fā)酵終點L-Glu-Na的殘留。L-Glu-Na殘留量在34℃時為0.50±0.03 g/L，雖高于0.13 g/L，但已是最低值，且較其他發(fā)酵溫度組均具備顯著性差異（P<0.05）。故確定34℃為最適發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵溫度對單菌種發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.1 Influenceof fermentation temperature on result offermentation with singlestrain

2.1.2 最適發(fā)酵時間的確定 對發(fā)酵時間的合理控制有助于提高效率，降低成本。由圖2可知，發(fā)酵時間為12～24 h時，GABA產(chǎn)量增長緩慢；進(jìn)入24～48 h階段，GABA產(chǎn)量隨時間延長增加顯著（P<0.05）；當(dāng)發(fā)酵時間進(jìn)一步延長至48～60 h階段，GABA產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，GABA產(chǎn)量為0.68±0.02 g/L，已達(dá)到最大產(chǎn)量的95%左右。此外，活菌數(shù)表現(xiàn)為在12～24 h階段顯著（P<0.05）增長，在24～60 h階段持續(xù)下降（P<0.05）。結(jié)合菌株生長曲線和GABA產(chǎn)量曲線，可以發(fā)現(xiàn)GABA的生產(chǎn)過程可以大致分為兩個階段：12～24 h為延滯期，24～60 h為積累期。推測可能是因為：在延滯期，發(fā)酵乳液中營養(yǎng)豐富，菌株快速生長并大量產(chǎn)酸，導(dǎo)致酸度顯著增加（P<0.05），pH降低，形成酸性環(huán)境。在此階段，GAD活性活性增加較慢[5]。隨后酸性環(huán)境激活并誘導(dǎo)GAD表達(dá)[17]，L-Glu-Na脫羧反應(yīng)得以順利進(jìn)行，GABA開始生成并進(jìn)入積累期。隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵乳液內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，菌株個體間競爭加劇[18]，活菌數(shù)減少，導(dǎo)致反應(yīng)速度和產(chǎn)物積累速度逐漸減緩。4043號菌種對應(yīng)的GABA產(chǎn)量變化滯后于活菌數(shù)變化的現(xiàn)象，與植物乳桿菌WZ011（Lactobacillllus plantarumWZ011）在GYP培養(yǎng)基中的發(fā)酵動力學(xué)曲線（優(yōu)化前后）類似[19]。當(dāng)發(fā)酵時間為60 h時，雖然L-Glu-Na殘留量顯著小于48 h時的殘留量（P<0.05），但GABA產(chǎn)量幾乎沒有增加，加之發(fā)酵時間過長會導(dǎo)致酸奶乳清析出增多，影響酸奶表觀和感觀評價。綜合考慮生產(chǎn)成本和發(fā)酵周期，確定48 h為最適發(fā)酵時間。

圖2 發(fā)酵時間對單菌種發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2 Influence of fermentation timeon result of fermentation with single strain

2.1.3 最適發(fā)酵接種量的確定 接種量大小對活菌數(shù)和GAD酶總量有直接的影響。由圖3可知，當(dāng)接種量從2%（v/v）增至5%（v/v）時，GABA產(chǎn)量隨著接種量增加而增大，至5%（v/v）時達(dá)到最高值約0.85±0.03 g/L。如接種量繼續(xù)增加，GABA產(chǎn)量則顯著降低（P<0.05）。究其原因，和活菌數(shù)、GAD與L-Glu-Na的相對量（濃度）變化有關(guān)。在發(fā)酵乳液中，底物即L-Glu-Na總量及濃度保持不變。當(dāng)接種量處于2%～5%的范圍內(nèi)，活菌數(shù)和GAD總量相對較少，底物L(fēng)-Glu-Na總量相對較高。此時增大接種量能夠加快轉(zhuǎn)化效率，提升代謝產(chǎn)物即GABA的產(chǎn)量。從圖3A可以看出，該階段又可分為兩個區(qū)間：當(dāng)接種量小于3.4%（v/v）時，GAD對L-Glu-Na的轉(zhuǎn)化比例低于50%，導(dǎo)致L-Glu-Na殘留量大于GABA產(chǎn)量，可稱為“次優(yōu)區(qū)間”；當(dāng)接種量超過3.5%（v/v）時，GAD對L-Glu-Na的轉(zhuǎn)化效率高于50%，GABA產(chǎn)量開始高于L-Glu-Na殘留量，可稱為“最優(yōu)區(qū)間”。而當(dāng)接種量超過5%（v/v）時，菌體濃度過大，無法與底物有效結(jié)合，菌株個體間競爭抑制了GAD的轉(zhuǎn)化效率[20]。這導(dǎo)致GABA產(chǎn)量下降，L-Glu-Na殘留量升高，加之發(fā)酵乳液內(nèi)有限的營養(yǎng)物質(zhì)不足以支持全體菌株生長，活菌數(shù)最終也會減少?？梢?，適宜的接種量更利于GABA產(chǎn)量積累。當(dāng)接種量為5%（v/v）時，GABA產(chǎn)量最高，且L-Glu-Na殘留量顯著優(yōu)于其余各接種量組（P<0.05）。故確定5%（v/v）為最適發(fā)酵接種量。

圖3 接種量對單菌種發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3 Influence of inoculation quantity on result of fermentation with singlestrain

2.1.4 最適L-Glu-Na添加量的確定L-Glu-Na添加量與GABA產(chǎn)量、GAD活性及酸奶口感均關(guān)系密切。由圖4可知，當(dāng)L-Glu-Na添加量從0 g/L增大至4 g/L，GABA產(chǎn)量同步增加，至4 g/L時GABA產(chǎn)量達(dá)到最大值約1.03±0.03 g/L。而后隨著L-Glu-Na添加量繼續(xù)增大，GABA產(chǎn)量出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。推測可能與GAD活性變化有關(guān)。由圖4可知，L-Glu-Na添加量的變化對活菌數(shù)無顯著影響（P>0.05），即GAD總量基本保持不變。而L-Glu-Na作為GABA的底物，不但可以影響GABA的生成量，還可通過調(diào)節(jié)GABA代謝支路中碳流量的變化，調(diào)節(jié)GAD活性[21]。當(dāng)L-Glu-Na添加量介于0～4 g/L時，底物濃度相對較低，轉(zhuǎn)化反應(yīng)相當(dāng)于酶促反應(yīng)中一級反應(yīng)或混合反應(yīng)階段，加之此階段GAD活性隨L-Glu-Na濃度升高而升高[5]，GABA產(chǎn)量隨之顯著增加（P<0.05）。當(dāng)L-Glu-Na添加量超過4 g/L時，底物濃度相對過高，將GAD飽和，轉(zhuǎn)化反應(yīng)受到反饋抑制，GAD酶活降低[14]，導(dǎo)致GABA產(chǎn)量隨之下降，L-Glu-Na殘留量也因未能充分反應(yīng)而迅速增加至約2.10±0.15 g/L，嚴(yán)重影響酸奶風(fēng)味。綜合GABA產(chǎn)量和感官評價，確定最適L-Glu-Na添加量為4 g/L。

圖4 L-Glu-Na添加量對單菌種發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.4 Influence of L-Glu-Na quantity on result of fermentation with single strain

根據(jù)課題組前期研究的結(jié)果，優(yōu)化發(fā)酵條件前，將4043號菌以3%（v/v）接種于含L-Glu-Na 2 g/L的10%（w/v）脫脂復(fù)原乳中，在30℃下單菌種發(fā)酵48 h，GABA產(chǎn)量約為0.39±0.07 g/L。優(yōu)化發(fā)酵條件后，當(dāng)L-Glu-Na添加量為4 g/L、接種量為5%（v/v）時，4043號菌在34℃下于10%（w/v）的脫脂復(fù)原乳中恒溫發(fā)酵48 h，GABA產(chǎn)量最高可達(dá)1.03±0.03 g/L，是優(yōu)化前的約2.64倍。相比之下，趙樹平等[22]從國產(chǎn)酸馬奶中篩選的瑞士乳桿菌ND01（Lactobacillus helveticusND01），按3%（v/v）接種于11%（w/v）的滅菌復(fù)原乳中，在37℃下單菌發(fā)酵30 h，GABA產(chǎn)量最高約0.17 g/L。賢乾隆等[23]從國內(nèi)酸菜和酸奶中分離得到的干酪乳桿菌QL-20（Lactobacillus caseiQL-20），按3%（v/v）接種至含L-Glu-Na 1%（w/v）的12%（w/v）的脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃下單菌發(fā)酵48 h后，發(fā)酵乳中GABA產(chǎn)量約0.29 g/L。韓嘯等[24]將從新鮮糞便中分離得到的短乳桿菌DL1-11（Lactobacillus brevisDL1-11）接種于（接種量6×107CFU/mL）蔗糖添加量5%（w/v）、L-Glu-Na添加量0.15%（w/v）的11%（w/v）的脫脂復(fù)原乳中，在35℃下單菌發(fā)酵9 h后，GABA產(chǎn)量最高達(dá)到101.20±2.48 mg/100 g。4043號菌在當(dāng)前工藝條件下的GABA產(chǎn)量優(yōu)于上述文獻(xiàn)報道的產(chǎn)量，但L-Glu-Na殘留量約0.69±0.09 g/L，殘留量過高，導(dǎo)致酸奶綜合感官評分很低。此外，課題組前期動物實驗結(jié)果表明，GABA的有效劑量應(yīng)不低于300 mg/d。若產(chǎn)品的攝入量為200 mL/d，則產(chǎn)品中GABA濃度應(yīng)高于1.50 g/L。

為解決上述問題，可通過多種乳酸菌的復(fù)配和混合發(fā)酵，充分發(fā)揮菌種各自的發(fā)酵性能[25]。如薛玉清等[26]將從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶中篩選的植物乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）按照0.5:0.5:1.5的比例、總接種量為2%（v/v）接種至滅菌乳中，在43℃恒溫混合發(fā)酵3.6 h，GABA產(chǎn)量超過了1.51 g/L。韓梅等[16]將光明乳業(yè)實驗室保藏的嗜酸乳桿菌gm-11（Lactobacillus acidophilusgm-11）和嗜熱鏈球菌gm-12在均質(zhì)后的牛奶中混合發(fā)酵，在總接種量為1×106CFU/mL時，不同接種比例組在發(fā)酵終點的GABA產(chǎn)量均明顯高于兩種菌各自單菌發(fā)酵的產(chǎn)量，且當(dāng)gm-11：gm-12為5:1時，GABA產(chǎn)量最高達(dá)5.62 g/L。Han等[27]將一株產(chǎn)GABA的嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）按1:1（接種量均為1×106CFU/mL）接種于含L-Glu-Na為15 g/L的脫脂乳液中，在37℃下混合發(fā)酵48 h后，GABA產(chǎn)量達(dá)到8.3 g/L，是其單菌發(fā)酵時的2.96倍。可見，復(fù)配多菌種混合發(fā)酵有助于進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件，顯著提升發(fā)酵效率和GABA產(chǎn)量。

2.2 雙菌種混合發(fā)酵單因素實驗結(jié)果

2.2.1 雙菌種復(fù)配方案及最適發(fā)酵溫度的確定 課題組前期的研究結(jié)果表明，1060號菌、1134號菌和1443號菌均不具備GABA合成能力。將三種菌接種于發(fā)酵乳液中，在各自最適生長溫度下（1060號菌的最適生長溫度為37～45℃，1134號菌和1443號菌均為37℃[28]）恒溫發(fā)酵48 h后，酸奶的乳清析出控制均能滿足GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中的感官要求。參照前期預(yù)實驗的結(jié)果，將三種菌分別與4043號菌按照1:1復(fù)配，進(jìn)行雙菌種混合發(fā)酵實驗?；?.1.1的實驗結(jié)果及三種復(fù)配菌的最適生長溫度，選擇34和37℃以研究不同發(fā)酵溫度對混合發(fā)酵GABA產(chǎn)量的影響，結(jié)果如表4所示。

由表4中可見，各復(fù)配組在34℃下的GABA產(chǎn)量和L-Glu-Na殘留量均優(yōu)于37℃下的結(jié)果，且組間均存在顯著性差異（P<0.05），故確定34℃為多菌混合發(fā)酵的最適發(fā)酵溫度。在34℃下，1134號復(fù)配組和1443號復(fù)配組的GABA產(chǎn)量均略優(yōu)于4043號菌單菌發(fā)酵時的最大產(chǎn)量1.03±0.03 g/L，而L-Glu-Na殘留量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于4043號菌的0.69±0.09 g/L。推測是復(fù)配菌種間的共生作用所致[29]。如傳統(tǒng)酸奶的發(fā)酵劑多由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌復(fù)配而成。在混合發(fā)酵時，嗜熱鏈球菌生長性能好，產(chǎn)酸速率高，能夠在發(fā)酵初期迅速創(chuàng)造酸性環(huán)境[30]，并為德氏乳桿菌保加利亞亞種提供生長所需的葉酸[31]、甲酸[32]和CO2[33]等物質(zhì)。而德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白水解能力較強，能夠生成多肽和氨基酸來促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長[34]。乳酸乳球菌乳酸亞種同樣具備較強的利用乳糖酵解乳酸的能力[35]，副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌均具備良好的耐酸能力[36?37]，復(fù)配組球菌、桿菌間具備互惠共生的基礎(chǔ)，同時也應(yīng)該具備增強菌種活力、提升L-Glu-Na向GABA的轉(zhuǎn)化效率等效果。因1443號復(fù)配組在發(fā)酵終點的乳清析出控制優(yōu)于1134號復(fù)配組，故確定1443號菌作為雙菌種混合發(fā)酵的復(fù)配菌種。

表4 菌種復(fù)配和發(fā)酵溫度的影響Table 4 Effects of strain collocation and fermentation temperature

2.2.2 最適發(fā)酵時間的確定 由圖5可知，對于雙菌種混合發(fā)酵，在12～48 h時階段，GABA產(chǎn)量隨發(fā)酵時間延長顯著增加（P<0.05）；隨著發(fā)酵時間進(jìn)一步延長，GABA產(chǎn)量反而有所降低。結(jié)合2.1.2可知，發(fā)酵溫度對雙菌種混合發(fā)酵GABA產(chǎn)量的影響與對單菌種發(fā)酵GABA產(chǎn)量的影響類似。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，GABA產(chǎn)量達(dá)到最高值，約1.05±0.02 g/L；L-Glu-Na殘留量約為0.08±0.01 g/L，低于其在酸奶中的呈鮮閾值，且與其他發(fā)酵時間組間存在顯著性差異（P<0.05）。綜合考慮GABA產(chǎn)量與生產(chǎn)周期，選擇48 h為多菌混合發(fā)酵的最適發(fā)酵時間。值得注意的是，在L-Glu-Na添加量和4043號菌種接種量相同的前提下，雙菌種混合發(fā)酵的活菌數(shù)、酸奶酸度、GABA產(chǎn)量和產(chǎn)率均明顯高于單菌種發(fā)酵相同發(fā)酵時段的各對應(yīng)結(jié)果，而酸奶pH和L-Glu-Na殘留量均明顯低于各對應(yīng)結(jié)果。這證明了2.2.1中有關(guān)雙菌種混合發(fā)酵能夠顯著增強菌種活力、產(chǎn)酸能力及提升L-Glu-Na向GABA的轉(zhuǎn)化效率等推論。

圖5 發(fā)酵時間對雙菌種混合發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.5 Influence of fermentation time on result of mixing fermentation with double strains

2.2.3 最適總接種量的確定 由圖6可知，總體而言，總接種量增大對雙菌種混合發(fā)酵的GABA產(chǎn)量影響不大：當(dāng)總接種量由4%（v/v）增至6%（v/v）時，GABA產(chǎn)量有顯著增長（P<0.05）；但在6～12%（v/v）區(qū)間，GABA產(chǎn)量基本穩(wěn)定，略有波動。值得注意的是，自初始總接種量起，雙菌種混合發(fā)酵始終處于“最優(yōu)區(qū)間”內(nèi)，GABA產(chǎn)量始終明顯高于L-Glu-Na殘留量。這表明在發(fā)酵乳液中，活菌和GAD的濃度始終低于L-Glu-Na的濃度。而GABA產(chǎn)量未跟隨總接種量的增大而提升，應(yīng)為乳酸乳球菌乳酸亞種GAD的pH活性范圍較窄、pH依賴性較強所致[38]。雙菌種混合發(fā)酵顯著增強了菌種的產(chǎn)酸能力，使酸奶酸度明顯升高，pH明顯降低。當(dāng)總接種量大于6%（v/v）時，酸奶pH已降至4.0以下，明顯低于GAD的最適pH4.7[39?40]，使其相對酶活低于50%[38]。此時繼續(xù)增大總接種量，雖能提升GAD總量，但會使酸奶pH和GAD相對酶活進(jìn)一步降低，導(dǎo)致總體轉(zhuǎn)化效率和GABA產(chǎn)量變化不大。從生產(chǎn)成本的角度出發(fā)，總接種量6%（v/v）為宜。此時GABA產(chǎn)量約1.82±0.22 g/L，L-Glu-Na殘留量約0.52±0.15 g/L。

圖6 總接種量對雙菌種混合發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.6 Influence of total inoculation quantity on result of mixing fermentation with double strains

2.3 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果

U12（12×63）混合水平均勻設(shè)計實驗的結(jié)果如表5所示。利用DPS 7.05軟件對各指標(biāo)進(jìn)行二次多項式逐步回歸分析，結(jié)果如表6所示。

表5 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Table 5 Results of uniform experiment

表6 指標(biāo)模型Table 6 Model of varies parameters

其中，各因子對GABA影響主次順序為X3（P=0.0004）> X32（P=0.0004）>X1X2（P=0.0055）> X42（P=0.0293）>X3X4（P=0.1273）>X2X4（P=0.1986）。選擇Y2即GABA產(chǎn)量最大值對模型方程進(jìn)行最值參數(shù)優(yōu)化，計算可得，當(dāng)發(fā)酵時間為48.42 h、L-Glu-Na添加量為8 g/L、發(fā)酵溫度為32.23℃、球菌與桿菌配比為1:3時，發(fā)酵終點GABA理論產(chǎn)量約3.84 g/L。

2.4 驗證性實驗結(jié)果

根據(jù)模型方程最值參數(shù)優(yōu)化結(jié)果，選擇如下發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行驗證性實驗：發(fā)酵時間為48 h、發(fā)酵溫度為32℃、L-Glu-Na添加量為8 g/L、球菌與桿菌配比為1:3。進(jìn)行3次平行試驗，測得發(fā)酵終點酸奶中GABA實際產(chǎn)量為4.10±0.10 g/L，是優(yōu)化前的3.78倍。L-Glu-Na殘留量約0.11±0.01 g/L，低于其酸奶中的呈鮮閾值；活菌數(shù)為3.03×1010±1.75×1010CFU/g，酸度值為129.67±2.08°T，且酸奶各項指標(biāo)均能夠滿足GB19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中的相關(guān)規(guī)定，略優(yōu)于模型預(yù)測值。不足是口感偏酸，綜合感官評分約78.42±4.63分，屬中上水平。該模型方程能夠較為準(zhǔn)確地分析各因素對雙菌種混合發(fā)酵酸奶中GABA產(chǎn)量的影響。

3 結(jié)論

本研究利用課題組前期篩選得到的在乳基底物中具備高產(chǎn)GABA潛力的乳酸乳球菌乳酸亞種菌種與干酪乳桿菌復(fù)配，以脫脂復(fù)原乳液為主要原料，進(jìn)行雙菌種混合發(fā)酵實驗。經(jīng)單因素實驗和均勻?qū)嶒?，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度32℃、L-Glu-Na添加量8 g/L、乳酸乳球菌乳酸亞種與干酪乳桿菌配比1:3。最終得到酸奶中GABA產(chǎn)量約4.10±0.10 g/L，是優(yōu)化前的3.78倍，酸奶各項指標(biāo)滿足GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中的相關(guān)規(guī)定，綜合感官評分良好。該工藝簡化了流程，降低了成本，GABA生產(chǎn)能力突出，可應(yīng)用于富含GABA功能性酸奶的生產(chǎn)開發(fā)中。