西藏產(chǎn)區(qū)葡萄表皮及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

張二豪，趙潤(rùn)東，尹 秀，蔡 皓，祿亞洲，羅 章

（西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

西藏昌都市芒康縣和林芝市位于西藏東南部，該地區(qū)具有光照充足、陽光輻射強(qiáng)、土壤砂質(zhì)深厚、晝夜溫差大等獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，為葡萄種植提供了得天獨(dú)厚的環(huán)境條件，以此原料釀造的葡萄酒香氣濃郁、口感飽滿，因此，素有“中國(guó)野生紅葡萄之鄉(xiāng)”和“西藏紅酒之鄉(xiāng)”之稱。

根際土壤微生物是葡萄園生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分，在土壤能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝等方面扮演著重要角色[1]。根際存在多種對(duì)植物有益的微生物類群，如生防菌、固氮菌及能產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素的微生物，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)吸收和能量代謝影響較大，因此，其微生物多樣性是土壤質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[2?4]。葡萄表皮上的微生物復(fù)雜多樣，其微生物群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)后續(xù)葡萄酒釀造及葡萄酒品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定的影響[5]。Bedriana等[6]研究表明，本土酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，芳香類化合物含量顯著增加，Bokulich等[7]在研究增芳德葡萄表皮微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)Candida zemplinina真菌能夠增強(qiáng)葡萄酒的感官品質(zhì)。葡萄根際土壤及葡萄表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成受地理因素、氣候條件、葡萄品種和土壤理化性質(zhì)等因素影響，魏玉潔等[8]在研究新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)、葉片及根際土壤微生物多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)葡萄園地理位置不同，其微生物多樣性存在差異，且Saccharomyces、Sordaria、Tetracladium和Geomyces是土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，而葡萄表皮真菌以Aureobasidium、Cryptococcus、Aspergillus和Sporospora為主；王偉等[9]發(fā)現(xiàn)新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄園土壤微生物多樣性存在顯著差異，且Guehomyces、Gibberella和Tetracladium是土壤真菌的優(yōu)勢(shì)類群。楊敏等[10]發(fā)現(xiàn)香格里拉產(chǎn)區(qū)不同葡萄園間根際土壤菌群豐度存在差異，且土壤微生物群落受土壤電導(dǎo)率、有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量影響；張世偉等[11]研究表明葡萄品種是影響其表皮微生物多樣性的重要因素。綜上所述，葡萄表皮及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成與其生長(zhǎng)環(huán)境和葡萄品種等諸多因素有關(guān)。西藏獨(dú)特的地理位置和氣候環(huán)境，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，研究葡萄表皮及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成，對(duì)篩選和利用葡萄酒產(chǎn)區(qū)特色微生物具有重要意義。目前，有關(guān)國(guó)內(nèi)外產(chǎn)區(qū)葡萄表皮、根際土壤微生物的研究較多[7?10,12]，而西藏產(chǎn)區(qū)葡萄表皮及根際土壤微生物的研究尚未見報(bào)道。

高通量測(cè)序技術(shù)由于其通量大、準(zhǔn)確性高、能基本反映自然界中微生物的真實(shí)情況等優(yōu)點(diǎn)，在生物學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[13?14]。因此，本文采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏昌都芒康和林芝2個(gè)產(chǎn)區(qū)黑珍珠葡萄園中的釀酒葡萄表皮和根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進(jìn)行研究，揭示不同產(chǎn)區(qū)核心微生物菌群的作用，以期為篩選利用本土特色釀酒微生物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑珍珠葡萄及葡萄根際土壤 于2019年9月分別從林芝市（緯度29°25'33.37"N，經(jīng)度94°26'50.93"E）和昌都市芒康縣（緯度29°1'53.1"N，經(jīng)度98°36'21.77"E）采集并將樣品命名如下：LG-林芝葡萄，MG-芒康葡萄，LS-林芝葡萄根際土壤，MS-芒康葡萄根際土壤；DNeasy Plant Mini Kit Qiagen,Germantown,MD，USA；2×Taq Master Mix，DNA片段純化試劑盒 天根生化科技有限公司；真菌通用引物（ITS1和ITS2） Invitrogen公司。

Eppendorf 5424R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Bio-Rad T100 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一；NanoDrop2000微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；漩渦混合器XH-D沃信公司；Illumina Misq 測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 隨機(jī)選取20株生長(zhǎng)良好的黑珍珠葡萄植株，并用無菌剪刀采集同一葡萄植株上、中、下3個(gè)部位的果實(shí)，置于無菌袋中，并混合均勻，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，?20℃保存?zhèn)溆?；按照田間根際土壤樣品采集方法采集根際土壤樣品[15]，除去雜質(zhì)并混合均勻，每組3個(gè)重復(fù)，放入無菌袋中，低溫保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根際土壤理化性質(zhì)分析 按照《土壤農(nóng)化分析》[16]操作步驟測(cè)定根際土壤樣品中的總磷（TP）、總鉀（TK）、總氮（TN）、有效磷（AP）、有效氮（AN）、p H、電導(dǎo)率（EC）和有機(jī)質(zhì)（SOM）含量。

1.2.3 樣品總DNA提取 稱50 g葡萄果實(shí)，加入200 mL PBS緩沖液（0.1 mol/L，p H7.0），200 r/min渦旋振蕩30 min，超聲15 min，0.22μm（Millipore，USA）微孔濾膜過濾，用無菌剪刀剪碎濾膜并放入無菌離心管中[11]。按照DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen,Germantown,MD，USA）操作步驟提取新鮮葡萄表皮和根際土壤樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量，并在NanoDrop ND-2000紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)所提DNA的濃度和純度。

1.2.4 樣品PCR 利用真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的通用引物對(duì)核糖體DNA的ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系（20 μL）如下：10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/L ITS1F和ITS2R引物各1μL，5 mmol/L dNTPs 1μL，5.0 U/μL rTaq酶0.2 μL，DNA模板1μL，補(bǔ)dd H2O至20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后委托上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用QIIME（Version 1.9.1）對(duì)Illumina MiSeq測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜、優(yōu)化、α多樣性和主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）；α多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和均勻度指數(shù)（Shannoneven），其中Chao1指數(shù)值越大，說明豐富度越高；Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明群落多樣性越高；在97%相似度下，利用UPARSE（7.0.1090）軟件進(jìn)行OTU聚類；通過RDP classifer（Version 11.5）軟件將OTU代表序列與真菌UNITE數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行物種注釋并統(tǒng)計(jì)各樣本在各分類水平下的相對(duì)豐度和群落組成；利用Mothur（Version 1.30.2）軟件進(jìn)行α多樣性分析；利用R語言進(jìn)行韋恩圖、冗余分析（RDA，redundancy analysis）和熱圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品根際土壤理化性質(zhì)分析

根際土壤理化性質(zhì)由表1可知，MS樣品中的總磷（TP）、總氮（TN）、速效氮（AN）、電導(dǎo)率（EC）和土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）含量均顯著高于LS，而MS樣品中的速效磷（AP）含量顯著低于LS（P<0.05），但兩地樣品中的總鉀（TK）含量無顯著差異，兩地土壤pH差異顯著（P<0.05），LS土壤偏酸性，而MS土壤偏堿性。

表1 樣品根際土壤理化性質(zhì)分析Table 1 Physical and chemical properties of rhizosphere soil samples

2.2 樣品真菌群落多樣性分析

本研究共獲得546888條有效序列，隸屬12門，37綱，86目，176科，357屬；LG、MG、LS和MS樣品所產(chǎn)生的OTUs數(shù)分別為114、150、297和794。LG樣品中所獲得的OTUs低于MG，MS樣品中所獲OTUs顯著大于LS。稀釋曲線分析結(jié)果如圖1A所示，隨著測(cè)序深度的增加，稀釋曲線逐漸趨于平坦，各樣本的測(cè)序覆蓋度均大于99.99%，說明此次測(cè)序結(jié)果能基本反映樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組成的真實(shí)情況。韋恩圖分析結(jié)果如圖1B所示，4個(gè)樣本中共獲得的物種數(shù)為1008種，共同擁有的物種數(shù)為22種，LG和MG共同擁有的物種數(shù)為46種，LS和MS共同擁有的物種數(shù)為140種，LG、MG、LS和MS樣品中特有物種數(shù)分別為17、47、121和593種。α多樣性分析結(jié)果如表2所示，MS樣品中真菌群落多樣性和豐富度指數(shù)最高，MG樣品中真菌群落均勻度指數(shù)最高，而LG樣品中真菌群落多樣性、豐富度和均勻度指數(shù)最低。總體而言，芒康地區(qū)葡萄和根際土壤真菌種類最多，多樣性指數(shù)最高，這可能與芒康土壤性質(zhì)有關(guān)，芒康葡萄園土壤以腐殖土為主，而林芝葡萄園土壤以沙土為主。

表2 樣品真菌群落多樣性Table 2 Fungal diversity indexes in different samples

圖1 稀釋曲線（A）和OTU韋恩圖（B）Fig.1 Rarefaction curves（A）and Venn chart of OUT（B）

2.3 樣品真菌群落組成分析

樣品真菌在門分類水平相對(duì)豐度如圖2所示，不同樣品真菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平組成差異較大，LG樣品門數(shù)最少，為2個(gè)門，MS最多，為11個(gè)門。子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在不同樣品中廣泛存在，它們的相對(duì)豐度分別為76.06%～99.60%、0.40%～12.21%。Mortierellomycota是MS中的次優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度為20.17%，壺菌門（Chytridiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）和Kickxelomycota是MS樣品中特有的門，其平均相對(duì)豐度分別為0.12%、0.06%、0.01%和0.003%，而Mucoromycota是LS樣品中特有的門，其平均相對(duì)豐度為0.03%。

圖2 樣品真菌門分類水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.2 Composition of fungal community in the samples at phylum level

屬分類水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖3所示，枝孢屬（Cladosporium）和青霉屬（Penicilium）是LG樣品中的優(yōu)勢(shì)屬，其平均相對(duì)豐度分別為64.43%和23.31%；MG樣品中的優(yōu)勢(shì)屬是漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）和畢赤酵母屬（Pichia），其平均相對(duì)豐度分別為31.59%、26.78%和18.71%；鐮胞菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicilium）和枝孢屬（Cladosporium）是LS樣品中的優(yōu)勢(shì)屬，其平均相對(duì)豐度分別為50.02%、10.15%和8.18%；MS樣品中的優(yōu)勢(shì)屬是被孢霉屬（Mortierella）、unclassified_f_Didymellaceae和青霉屬（Penicilium），其平均相對(duì)豐度分別為20.16%、10.72%和7.82%。樣本聚類分析表明，不同地區(qū)的葡萄表皮和不同地區(qū)的根際土壤真菌被聚為一類。以上結(jié)果表明，不同樣品中的優(yōu)勢(shì)屬群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，而不同地理位置環(huán)境下的葡萄表皮和根際土壤真菌群落組成相似。

圖3 樣品真菌屬分類水平群落結(jié)構(gòu)組成熱圖Fig.3 Composition of fungal community in the samples at genuslevel

2.4 樣品真菌群落聚類分析

主成分分析（Principal coordinate analysis）結(jié)果如圖4所示，主成分分析PC1和主成分分析PC2對(duì)群落結(jié)構(gòu)組成差異的貢獻(xiàn)率分別為39.98%和24.48%，合計(jì)64.46%，是差異的主要來源，能夠很好的區(qū)分不同地區(qū)的葡萄和根際土壤樣品。樣本層級(jí)聚類分析如圖5所示，不同地區(qū)的葡萄樣品和根際土壤樣品聚為一類，說明不同地區(qū)的葡萄和不同地區(qū)的根際土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。

圖4 真菌群落PCA分析Fig.4 Principal coordinate analysis of fungal communities

圖5 UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis

2.5 門分類水平樣品真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子冗余分析

土壤理化性質(zhì)對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示，TK、TP、AN、TN和p H對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)組成有影響，其中TK影響最大，而AP、SOM和EC不影響真菌群落結(jié)構(gòu)組成；MG樣品真菌群落結(jié)構(gòu)與TP、AN、TN和pH呈正相關(guān)，而與TK呈負(fù)相關(guān)，LG和MS則相反，LS樣品與TK呈正相關(guān)，而與TP、AN、TN和pH呈負(fù)相關(guān)。在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）豐度變化與TK、TP、AN、TN和p H呈負(fù)相關(guān)，而Mortierellomycota豐度變化與TP、AN、TN和TK呈正相關(guān)，與p H呈負(fù)相關(guān)，而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）豐度變化與TP、AN、TN和pH呈正相關(guān)，而與TK呈負(fù)相關(guān)。

圖6 真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis biplot between the fungal community and environment factor

3 討論與結(jié)論

本研究利用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏產(chǎn)區(qū)昌都芒康縣和林芝市兩個(gè)地區(qū)的葡萄表皮及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MS樣品中的總磷、總氮、速效氮、電導(dǎo)率和土壤有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于LS，這可能與土壤類型有關(guān)，MS以腐殖質(zhì)為主，而LS以沙土為主；有研究表明，根際土壤作為一個(gè)天然的微生物資源庫，為微生物生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8,17]，楊敏等[10]發(fā)現(xiàn)香格里拉產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤微生物群落受土壤電導(dǎo)率、有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量影響。在門分類水上，子囊菌門（Ascomycota）是葡萄表皮和根際土壤真菌的優(yōu)勢(shì)菌門，Pinto等[18]和Stevanato等[19]研究表明，子囊菌門（Ascomycota）是葡萄和根際土壤真菌的優(yōu)勢(shì)類群，這與本文研究結(jié)果一致。MS樣品中檢測(cè)到的真菌門最多，而LS樣品中檢測(cè)到相對(duì)較少的真菌門，這可能是兩地土壤理化性質(zhì)有關(guān)[20?23]。在屬分類水平上，枝孢屬（Cladosporium）和青霉屬（Penicilium）是LG樣品中的優(yōu)勢(shì)屬，而MG樣品中的優(yōu)勢(shì)屬是漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）和畢赤酵母屬（Pichia），兩地葡萄表皮真菌差異較大，這可能與兩地葡萄栽培、管理和殺菌劑等因素有關(guān)[24]。魏玉潔等[8]在研究新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)葡萄表皮真菌以Aureobasidium、Cryptococcus、Aspergillus和Sporospora為主，趙昱等[25]研究表明短梗霉屬（Aureobasidium）和紅酵母屬（Rhodotorula）是四個(gè)產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄表皮真菌的優(yōu)勢(shì)屬，與本文研究結(jié)果差異較大，可能與氣候環(huán)境和葡萄品種等因素有關(guān)。兩地根際土壤真菌群落組成差異較大，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能受果園土壤理化性質(zhì)及果園果樹自身種類、覆草、施肥、農(nóng)藥等因素影響[26?27]，因此以上因素可能是導(dǎo)致兩地根際土壤真菌群落組成差異的關(guān)鍵因素。α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，MS樣品真菌多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)明顯高于LS，且MG明顯高于LG，可能與兩地土壤理化性質(zhì)、施肥及水源等因素有關(guān)，張翔等[28]研究發(fā)現(xiàn)生物有機(jī)肥可顯著提高果園土壤微生物的豐富度和多樣性，趙昱[25]研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄微生物存在的差異性可能與氣候、水源、栽培等因素有關(guān)，楊敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)氣候和土壤差異可能是導(dǎo)致根際微生物差異的重要原因。

眾所周知，酵母菌是葡萄酒釀造的關(guān)鍵菌株，目前已報(bào)道的與釀酒相關(guān)的酵母菌高達(dá)24屬120余種。酵母菌在釀造過程中能夠?qū)⑻穷愇镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇及其他次生代謝產(chǎn)物并釋放多種香氣物質(zhì)，同時(shí)能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；Bedriana等[6]研究表明，本土酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵能夠增加芳香類化合物和風(fēng)味物質(zhì)的合成，提高葡萄酒的香氣，本文在MG樣品中檢測(cè)到大量漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、Metschnikowia、Vishniacozyma和畢赤酵母屬（Pichia），說明芒康地區(qū)葡萄富含與釀酒相關(guān)的酵母菌，可為本地釀酒酵母菌株的篩選、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏兩個(gè)地區(qū)葡萄表皮和根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成的進(jìn)行分析。結(jié)果表明，兩地土壤理化性質(zhì)差異較大，RDA分析可知，總磷、總氮和速效氮對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)組成影響較大；MS樣品真菌多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均明顯高于LS，且MG明顯高于LG；在門水平，各樣品中的優(yōu)勢(shì)菌是子囊菌門（Ascomycota），在屬水平，各樣品的優(yōu)勢(shì)屬差異較大，枝孢屬（Cladosporium）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、鐮胞菌屬（Fusarium）和被孢霉屬（Mortierella）分別是LG、MG、LS和MS樣品的優(yōu)勢(shì)屬；主成分分析及樣本聚類分析表明，不同地區(qū)的葡萄表皮和根際土壤真菌群落組成相似，這可能與樣品特異性等因素有關(guān)；同時(shí)在芒康地區(qū)發(fā)現(xiàn)較多與釀酒相關(guān)的酵母菌，可為本地釀酒菌株的篩選和利用提供理論依據(jù)。