黃海綠潮漂移過程中滸苔揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究

趙莉娟，李崇翔，喬 橋，王鈺珺，曹 軒，楊麗麗，張建恒*，何培民*

1上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院；2水域環(huán)境生態(tài)上海高效工程研究中心，上海 201306

滸苔類綠藻廣泛分布于世界各地，有的生長在海水或淡水河流中，有的生長在潮間帶的巖石或泥沙灘的竹筏等附著基上[1]。目前全世界已知的滸苔種類有80余種，中國約有11種[2]。有些綠藻快速生長聚集在一起而引起綠潮。綠潮暴發(fā)會帶來一系列的次生環(huán)境問題，如藻體大量漂浮在海水表面，引起遮蔭效應(yīng)，導(dǎo)致底層植被無法進(jìn)行光合作用而退化死亡；藻體堆積在岸上腐敗散發(fā)惡臭，甚至滋生病菌；藻體沉降到海底后會引起缺氧和底質(zhì)腐敗，改變底層水體和沉積的物理化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而對海洋生態(tài)環(huán)境和生態(tài)服務(wù)功能造成嚴(yán)重影響[3]。

自2007年以來，我國黃海已連續(xù)14年暴發(fā)大規(guī)模綠潮災(zāi)害，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，甚至威脅到我國近海生態(tài)安全。目前，國內(nèi)外科研工作者已對黃海綠潮源頭探索[4]、暴發(fā)機(jī)制[5]、漂移路徑[6]、預(yù)測預(yù)警[7]等進(jìn)行了深入研究，取得了一系列重要成果。引起黃海綠潮暴發(fā)的優(yōu)勢種滸苔(Ulvaprolifera)其實(shí)是一種經(jīng)濟(jì)海藻，據(jù)《本草綱目》和《隨恩居飲食譜》記載，它具有涼血、泄熱、利尿、消痰、軟堅(jiān)散和降低膽固醇等功效[8]。現(xiàn)代研究內(nèi)容主要體現(xiàn)在滸苔多糖上，滸苔多糖已被證明具有降血脂、抗氧化、提高免疫力和抑制皮膚癌等藥理活性[1]。此外，滸苔還有除菌洗滌、做纖維紡絲、吸聲材料以及修復(fù)富營養(yǎng)化海域生態(tài)[9]等作用。近年來，滸苔越來越多的被用于食品行業(yè)中，在日本和韓國，滸苔是一種奢侈的調(diào)味料，只在高檔料理中使用，價格高昂。在我國，滸苔被磨成藻粉，可添加到其他食品中，目前已產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)滸苔蝦仁、滸苔面條、滸苔麻花等產(chǎn)品。滸苔在應(yīng)用的過程中主要?dú)w功于其具有獨(dú)特的香味。因此，摸清綠潮滸苔藻體中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及成分對綠潮資源合理利用和發(fā)展至關(guān)重要。

目前國內(nèi)關(guān)于綠潮藻的研究常見于其種類鑒定[10]、生活史[11,12]、組織培養(yǎng)[13,14]、實(shí)驗(yàn)生態(tài)[15]等方面，對綠潮藻營養(yǎng)成分分析的研究已經(jīng)有了一定進(jìn)展，但多集中在對具體某一個地點(diǎn)或某一海域的綠潮藻進(jìn)行成分分析，關(guān)于綠潮藻在整個漂移過程中成分變化情況的研究，尤其是綠潮藻在整個漂移過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化情況的研究鮮有報(bào)道。本研究通過對綠潮漂移全程各個階段進(jìn)行樣品采集，并開展揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析，結(jié)合香氣閾值，篩選和確定不同區(qū)域綠潮優(yōu)勢種滸苔的主要香氣成分，為綠潮滸苔食品開發(fā)和資源化利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)歷年綠潮發(fā)生發(fā)展規(guī)律，2020年3月～7月采用船舶實(shí)時跟蹤監(jiān)測綠潮漂移路徑，并采集不同區(qū)域的漂浮綠潮藻(采樣站位見圖1，具體站位名稱見圖注)，將采集的樣品低溫條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用滅菌海水及毛筆刷去附著在藻體上的雜藻等。然后挑選出單株的健康綠潮藻，去除多余水分，用天根植物基因組DNA提取試劑盒DP305進(jìn)行總DNA的提取并測序鑒定。剩余樣品進(jìn)行干燥粉碎后備用。

圖1 采樣點(diǎn)位置圖Fig.1 Location diagram of sampling stations注：RD：如東；DF：大豐；SY：射陽；LYG：連云港；RZ：日照；QD：青島；HY：海陽；RS：乳山，下同。Note: RD: Rudong;DF: Dafeng;SY: Sheyang;LYG: Liangyungang;RZ: Rizhao;QD: Qingdao; HY: Haiyang;RS: Rushang,the same below.

1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒(DP305，天根)；水浴鍋(KW-1000DC，金壇市科析儀器有限公司)；丁位辛內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，上海源葉生物科技有限公司)；固相微萃取裝置(57330-U，supelco)；固相微萃取針50/30 um DVB/ CAR/PDMS (57348U，supelco)；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；氣相色譜柱：HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm，美國安捷倫公司)。

1.3 漂浮綠潮藻種類分子鑒定

每個站位隨機(jī)選取5株完整藻體用無菌海水清洗干凈，按照天根公司植物基因組小量抽提試劑盒DP305說明書提取基因組DNA，5S rDNA間隔序列引物設(shè)計(jì)以及擴(kuò)增程序同2012年。利用5S rDNA間隔區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)有限公司測序。應(yīng)用Clustal X(ver 2.0)軟件對樣品的5S rDNA間隔序列進(jìn)行多序列比對分析，然后應(yīng)用Mega 4.0軟件基于Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建聚類樹，以自舉檢驗(yàn)(bootstrap test)估計(jì)系統(tǒng)樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度，自舉值為1 000[10]。

1.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取方法

稱取5.0 g綠潮滸苔樣品放入10 mL頂空瓶中，密封，置頂空進(jìn)樣器中進(jìn)樣。頂空條件：樣品瓶加熱溫度60 ℃；樣品瓶加熱時間30 min，樣品平衡時間10 min，進(jìn)樣時間5 min。

1.5 GC-MS條件

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，氣質(zhì)接口溫度250 ℃，載氣流速1.5 mL/min。升溫程序：初始50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫到100 ℃保持2 min，4 ℃/min升溫到180 ℃保持3 min，5 ℃/min升溫到250 ℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，E電離70 eV，全掃描35～550 Da。

1.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定

采用Agilent MSD化學(xué)工作站，匹配Agilent NIST 質(zhì)譜庫，將檢測的各組分質(zhì)譜信息與 NIST 質(zhì)譜庫進(jìn)行匹配定性，結(jié)合人工圖譜解析、文獻(xiàn)核對等多種方法進(jìn)行綜合分析鑒定。僅報(bào)道正反匹配度均大于80(最大值100)的結(jié)果，除去儀器自身帶有的揮發(fā)性硅烷類雜質(zhì)、各類塑化劑與烷烴類成分，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 漂浮綠潮藻分子鑒定和分析

將8個站位隨機(jī)選取的40株漂浮綠潮藻樣品序列進(jìn)行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，所有樣品均被劃分至同一個進(jìn)化枝，其序列與Genebank中所錄入的樣品基因序列(HM584772.1)完全一致，確定所有漂浮綠潮藻樣品均為滸苔(Ulvaprolifera)。

圖2 基于5S rDNA間隔序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A neighbor joining tree constructed from the analysis based on 5S rDNA spacer sequences

2.2 不同區(qū)域綠潮藻揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果

8個區(qū)域綠潮藻樣品一共鑒定到187個化合物，如下圖所示，這些化合物被分成了7類，分別是醇類、醛類、烯類、酯類、酚類、烷類和其他類。

從上表1和上圖3可以看出，8個區(qū)域滸苔樣品的化合物類別大致相同，而各類別化合物數(shù)量和含量存在一定差異。如東綠潮藻滸苔樣品中的烯類、酮類和酯類物質(zhì)含量最高，射陽樣品醇類和酚類物質(zhì)含量最高，大豐樣品烷類物質(zhì)含量最高，青島樣品醛類物質(zhì)含量最高。每個區(qū)域綠潮藻的化合物組成和含量有很大的差別。

圖3 不同區(qū)域綠潮滸苔各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Fig.3 Contents of various volatile flavor substances for U.prolifera in different areas of Yellow Sea

表1 黃海不同區(qū)域綠潮藻滸苔揮發(fā)性物質(zhì)含量分析Table 1 Contents of volatile components for U.prolifera in the whole Yellow Sea

2.3 不同區(qū)域綠潮滸苔揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣味描述和氣味閾值

表2為不同區(qū)域綠潮藻滸苔揮發(fā)性化合物的氣味描述和香氣閾值。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，共得到58個揮發(fā)物的氣味描述，其中如東至乳山8個區(qū)域的綠潮藻分別含有19、19、19、19、18、17、14、21種化合物的揮發(fā)物氣味描述；在8個區(qū)域綠潮藻樣品中，酯類化合物含量較高且種類豐富，其中除海陽綠潮藻外均含有二氫獼猴桃內(nèi)酯，二氫獼猴桃內(nèi)酯具有木香和麝香氣味，其香氣閾值未見報(bào)道；除青島樣品外，其他樣品均含有棕櫚酸甲酯，而棕櫚酸甲酯具有輕微果香，其香氣閾值大于2 μg/kg。結(jié)合香氣成分在水中的閾值和化合物含量，初步分析如東綠潮藻的主要香氣成分為丁醇、1-戊烯-3-醇、環(huán)己烯、β-紫羅蘭酮、6，10，14三甲基-2-十五酮、二氫獼猴桃二酯、鄰苯二甲酸酯、棕櫚酸甲酯；大豐樣品的主要香氣成分為檸檬烯、β-紫羅蘭酮、6，10，14-三甲基-2-十五酮、3,5-辛二烯-2-酮、藏紅花醛、苯甲醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯；射陽綠潮藻的主要香氣成分為十八醇、檸檬烯、β-紫羅蘭酮、(E，E)-2，4-庚二烯醛、環(huán)高檸檬醛、苯甲醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、乙二醇丁基醚；連云港綠潮藻的主要香氣成分為十八醇、β-紫羅蘭酮、己醛、壬醛、棕櫚酸甲酯、乙酸乙酯；日照綠潮藻的主要香氣成分可能為十八醇、檸檬烯、β-紫羅蘭酮、反-2-己烯醛、己醛、壬醛、乙酸乙酯、對二甲苯；青島綠潮藻的主要香氣成分為檸檬烯、苯甲醛、反-2-己烯醛、己醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、壬醛、棕櫚酸乙酯、乙二醇丁基醚；海陽綠潮藻的主要香氣成分為十八醇、檸檬烯、β-紫羅蘭酮、庚醛、己醛、壬醛、棕櫚酸甲酯；乳山綠潮藻的主要香氣成分為檸檬烯、十二醛，反-2-己烯醛、棕櫚酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、對二甲苯。8個不同區(qū)域的綠潮藻存在相同的主要香氣成分，也有各自獨(dú)特的成分，導(dǎo)致不同地點(diǎn)的綠潮藻的氣味存在差異。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

表2 部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣味描述和閾值Table 2 Odor description and threshold of some component

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3 討論

本研究采用HS-SPME提取了黃海8個不同區(qū)域漂浮綠潮滸苔的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，通過GC-MS分析，結(jié)果表明這8個區(qū)域漂浮滸苔的主要風(fēng)味成分和含量不完全相同。醇類化合物一般氣味柔和，具有植物香，對綠潮藻整體氣味有著有益影響[24]。如東區(qū)域綠潮藻醇類物質(zhì)種類較豐富；其中，1-戊烯-3-醇、庚醇都具有芳香氣味，射陽綠潮藻中的十八醇含量較高，其呈香味，對綠潮藻氣味具有較大貢獻(xiàn)。對其他區(qū)域而言，尤其是綠潮漂移后期的山東近岸區(qū)域，其醇類物質(zhì)的含量和種類都在顯著下降。

在如東、大豐以及乳山綠潮藻檢測出的所有揮發(fā)性成分中，烯類是含量最高的成分，主要是8-十七烯、檸檬烯、苯乙烯等；其中，如東和大豐區(qū)域綠潮藻含有較高含量的8-十七烯，而日照、青島、海陽綠潮藻均未檢測到，8-十七烯是大型海藻共有的特征風(fēng)味物質(zhì)[24]，在龍須菜、紫菜、紅毛菜中都被檢測到；而8-十七碳烯是酶促反應(yīng)生成的一類化學(xué)感應(yīng)物質(zhì)，作為生物信息素在愈傷中起到一定的作用[25]，射陽、連云港及乳山綠潮藻中含有1-十二烯，其有強(qiáng)烈的刺激性氣味，對綠潮藻風(fēng)味有不利的影響。

酮類化合物一般具有花果香味，在綠潮藻漂移的過程中，各個區(qū)域綠潮藻的酮類物質(zhì)的含量和種類都在逐步下降，除乳山綠潮藻外均檢測到β-紫羅蘭酮；β-紫羅蘭酮具有類似松木香，稀時類似紫羅蘭香，是維生素A的重要合成原料，有利于綠潮藻的芳香味產(chǎn)生[24]；另外，茶香酮、香葉基丙酮、二氫-β-紫羅蘭酮這些物質(zhì)都是具有花香、果香等令人愉快的氣味，但在漂浮后期的綠潮藻中均未檢測到。

醛類化合物與形成各種特異香氣風(fēng)格有密切關(guān)系,有文獻(xiàn)報(bào)道醛類化合物閾值很低，對產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[24]。如東綠潮藻中藏紅花醛、環(huán)高檸檬醛含量較高，它們具有木香、辛香和甜香。在生物體內(nèi)，很多醛類物質(zhì)都來自脂肪酸，如己醛和戊醛是亞油酸的氧化裂解產(chǎn)物；脂肪醛大多呈現(xiàn)濃烈的果香風(fēng)味，還帶有些許面包香氣[24]。在漂浮后期的綠潮藻中均檢測到反-2-庚烯醛，其具有刺激臭氣味，對藻類的風(fēng)味產(chǎn)生不利的影響。

在所有綠潮藻檢測出的所有揮發(fā)性成分中，酯類化合物含量較高且種類豐富，一般酯類化合物具有令人愉悅的香氣，而且酯類化合物的氣味閾值一般較低，推測酯類化合物對綠潮藻的整體氣味有很大貢獻(xiàn)。研究結(jié)果表明，隨著綠潮藻的北向漂移，其酯類物質(zhì)的總體含量在逐步下降，例如二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯，它們都具有果香、木香的氣味，而且二氫獼猴桃內(nèi)酯在食品工業(yè)和卷煙工業(yè)中也有著重要的應(yīng)用價值[26]，但其含量隨著漂移整體在逐漸減少，對整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)也在減少。

值得注意的是在乳山樣品中檢測出一定含量的萘，這類化合物一般是由環(huán)境污染物不斷富集而形成的，這可能是導(dǎo)致乳山綠潮藻風(fēng)味不佳的原因[27]，另外，只在乳山樣品中檢測到噻唑和吡嗪類物質(zhì)，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[28]，其與滸苔的苦味有關(guān)系，這也間接證明了漂移后期綠潮藻風(fēng)味不佳。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量決定著綠潮藻的品質(zhì)。結(jié)合8個不同區(qū)域綠潮藻中化合物的含量和閾值，可知不同區(qū)域綠潮藻不僅具有特有的香氣特征成分，還具有相同的關(guān)鍵香氣成分，例如苯甲醛、環(huán)高檸檬醛、檸檬烯、β-紫羅蘭酮等。參考Li[29]的研究成果，海藻類揮發(fā)性成分的變化跟養(yǎng)殖海域有著密切的關(guān)系，且由于藻體本身對環(huán)境物質(zhì)有著較大的吸附能力，揮發(fā)性組分的變化就可能會跟養(yǎng)殖海區(qū)本底物質(zhì)的變化有關(guān)。結(jié)合對不同區(qū)域綠潮藻的分子鑒定結(jié)果，當(dāng)綠潮藻品種相同時，環(huán)境因子對綠潮藻的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響較大，在今后可深入研究環(huán)境因子如溫度，光照，海水水質(zhì)、營養(yǎng)鹽成分等方面對揮發(fā)性代謝物的影響。

4 結(jié)論

綠潮藻作為一種海洋資源，且有多種保健功效，具有很好的生產(chǎn)利用價值和市場開發(fā)前景。本研究通過采用頂空固相微萃取方法萃取綠潮藻的揮發(fā)性風(fēng)味成分并結(jié)合GC-MS聯(lián)用儀分析鑒定，可準(zhǔn)確檢測出黃海海域漂浮綠潮藻揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組分，初步確定了各個區(qū)域綠潮藻的主要香氣成分。結(jié)果表明不同區(qū)域的綠潮藻風(fēng)味不盡相同，在綠潮藻漂移過程中，從江蘇如東到山東乳山，其揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量都在逐漸下降，也表明了其整體品質(zhì)在下降。相比較而言，南黃海綠潮藻品質(zhì)較好，在實(shí)際應(yīng)用中可用作食品產(chǎn)品制作；而北黃海綠潮藻由于處于漂浮區(qū)域后期，其藻體狀態(tài)揮發(fā)性風(fēng)味都不佳，可打撈后用作飼料、肥料以及生物質(zhì)能源的開發(fā)。本研究為綠潮藻風(fēng)味物質(zhì)的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)綠潮藻的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。