銅綠假單胞菌噬菌體的分離篩選和體內(nèi)外抗菌活性研究*

陳全順，陳向東，汪 輝，楊 景，強俊磊，田宇航，李弘遠，蒲培熙

中國藥科大學 生命科學與技術(shù)學院，南京211198

銅綠假單胞菌一直是醫(yī)院感染的主要致病菌，該病原體高水平耐藥性嚴重威脅人類生命健康。噬菌體是特異性感染細菌的活病毒，也是地球上數(shù)量最多的生物體[1]，具有裂解耐藥菌、殺菌特異性強、對人體無副作用等獨特性的優(yōu)勢[2]，可能成為治療耐藥菌感染的新型抗菌劑。

本實驗以臨床分離的銅綠假單胞菌為宿主菌，從污水土壤樣品中分離篩選出強裂解性寬譜噬菌體進行生物學特性和體外抗菌活性分析，并進一步探索其治療小鼠全身感染的效果，為深入研究噬菌體應用于銅綠假單胞菌感染奠定基礎。

1 材 料

1.1 樣品和菌株

污水和土壤樣品采集于南京市江寧區(qū)自然環(huán)境。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由廣州南方醫(yī)院臨床檢驗室提供，大腸埃希菌ATCC25922由中國藥科大學微生物學教研室提供。

1.2 實驗動物

18～20 g 清潔級ICR 雌性小鼠，購買于揚州大學比較醫(yī)學中心，生產(chǎn)許可：SCXK（蘇）2017-0007，由中國藥科大學動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB、瓊脂粉、MHA 培養(yǎng)基（北京三藥科技有限公司）；上層和下層培養(yǎng)基為NB 中分別添加0.7%和1.5%瓊脂；SM 緩沖液參照文獻[3]配制；藥敏紙片（溫州市康泰生物技術(shù)有限公司）。

高速低溫離心機（Thermo 公司）；酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；GHX-9080B 恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；JEM-1400 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

2 方 法

2.1 噬菌體的分離篩選

2.1.1 藥敏紙片法篩選臨床耐藥菌過夜培養(yǎng)的菌液（銅綠假單胞菌和大腸埃希菌）用無菌生理鹽水稀釋到濃度為0.5 號麥氏比濁管，棉拭子沾取菌液，均勻涂布整個MHA 培養(yǎng)基表面，室溫靜置3 min，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，每個平皿貼5 片，培養(yǎng)16～20 h，測量抑菌圈直徑。

將篩選到的銅綠假單胞菌的耐藥菌株培養(yǎng)到對數(shù)生長期，各取3 mL 培養(yǎng)液混勻，作為分離噬菌體的混合菌液。

2.1.2 噬菌體的分離純化采集的污水和土壤樣品充分混勻，300 mL 的樣品混合液與NB 培養(yǎng)基干粉混合，加入新鮮的銅綠假單胞菌混合液，37 ℃、30 r·min-1輕微振蕩培養(yǎng)24 h，此步為噬菌體的富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)液8000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm 過濾器過濾除菌，濾液用SM 緩沖液倍比稀釋。雙層平板法[4]進行噬菌體的分離純化，在上層培養(yǎng)基中加入適宜稀釋梯度的濾液與銅綠假單胞菌菌液各0.2 mL，混勻后傾倒于下層培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)。次日挑取單個噬菌斑于SM 緩沖液，4 ℃冰箱靜置過夜，稀釋后作雙層平板，重復挑單斑3～5 次純化噬菌體。

2.1.3 噬菌體的篩選采用斑點法[5]篩選強裂解性噬菌體，取0.2 mL 菌液與上層培養(yǎng)基充分混勻，傾倒于下層培養(yǎng)基，凝固后滴加5 μL 噬菌體液，37 ℃培養(yǎng)。次日，滴有噬菌體處無菌生長且清晰透亮的即為強裂解性噬菌體。另外接種40 株銅綠假單胞菌作為指示菌，斑點法測定裂解譜。

2.2 噬菌體的主要生物學特性

2.2.1 透射電鏡觀察噬菌體純化后的高滴度噬菌體懸液（109～1010PFU·mL-1）滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，2%（w/v）磷鎢酸（pH7.2）進行負染色，電鏡觀察并采集圖像。

2.2.2 熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性檢測噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性，取0.5 mL 噬菌體液于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃孵育1 h，每個溫度作3 組重復，雙層平板法計數(shù)噬菌斑。

檢測噬菌體在不同pH 值下的穩(wěn)定性，將NB培養(yǎng)液調(diào)至不同pH 值（2、4、6、7、8、10、12），過濾除菌，與0.1 mL 噬菌體液混勻，每個pH 值作3 組重復，37 ℃孵育1 h，雙層平板法計數(shù)噬菌斑。

2.2.3 最佳感染復數(shù)和一步生長曲線將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照感染復數(shù)為0.001、0.01、0.1、1、10 比例分別加入噬菌體和宿主菌，每個比例3 組重復，搖床培養(yǎng)3 h，離心取上清液測滴度，產(chǎn)生最高噬菌體滴度的比例為最佳感染復數(shù)（the optimal multiplicity of infection，MOI）。

按最佳感染復數(shù)的比例混合宿主菌和噬菌體，37 ℃孵育15 min 后，離心棄上清液，沉淀物洗滌兩次再重懸沉淀，搖床培養(yǎng)，每間隔10 min 直至120 min取樣0.2 mL，離心取上清液測滴度。繪制噬菌體一步生長曲線，計算噬菌體的潛伏期、裂解期、裂解量（平臺期噬菌體的滴度/宿主菌初始濃度）。

2.3 噬菌體的體外抗菌活性

宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，噬菌體處理組按最佳感染復數(shù)的比例加入噬菌體，宿主菌對照組加入等量生理鹽水，37 ℃培養(yǎng)，分別在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 定時取樣檢測OD600值，每個時間點3 組重復。

2.4 噬菌體治療小鼠全身感染的效果

體重為18～20 g ICR 雌性小鼠20 只，隨機分為4 組，每組5 只。腹腔注射不同劑量的銅綠假單胞菌Pa24 菌液（2×107、2×108、2×109、2×1010CFU/只）,觀察小鼠7 天，引起一個組小鼠全部死亡的劑量為最小致死量。

體重為18～20 g ICR 雌性小鼠30 只，隨機分為3 組。噬菌體治療組（13 只）：注射最小致死量的銅綠假單胞菌菌液和噬菌體PPa24；模型對照組（13只）：注射最小致死量的銅綠假單胞菌菌液和生理鹽水；噬菌體對照組（4 只）：僅注射噬菌體PPa24。注射最小致死量的菌液5 h 后，噬菌體治療組和模型對照組隨機各選取5 只小鼠，眼眶采血100～200 μL 與肝素混合，梯度稀釋后進行平板菌落計數(shù)。其余小鼠持續(xù)觀察7 天，記錄每日死亡情況。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 噬菌體的分離篩選

3.1.1 臨床耐藥菌的篩選結(jié)果結(jié)合《臨床實驗標準研究所（CLSI）指南》，根據(jù)抑菌圈直徑，將每株菌的藥敏性分為敏感（S）、中介耐藥（I）、耐藥（R）三個級別，共篩選到27 株銅綠假單胞菌的耐藥菌株。本實驗分離到噬菌體的3 株銅綠假單胞菌Pa3、Pa24、Pa27 是分離自醫(yī)院患者傷口感染的病原菌，藥敏實驗結(jié)果如表1 所示，對5 類抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922 形成的抑菌圈符合藥敏標準。

表1 抑菌圈直徑（mm）和藥敏性

3.1.2 噬菌體的分離篩選結(jié)果噬菌體的富集培養(yǎng)液與銅綠假單胞菌Pa3、Pa24、Pa27 作雙層平板時出現(xiàn)了噬菌斑，說明噬菌體富集培養(yǎng)液中有針對這3 株銅綠假單胞菌的噬菌體。反復挑單斑純化，獲得3 株較純的噬菌體，分別命名為銅綠假單胞菌噬菌體PPa3、PPa24、PPa27。

噬菌體PPa24 的噬菌斑清晰且邊緣整齊，直徑0.80～1.21 mm，如圖1 所示。斑點法形成的噬菌斑完全清透，如圖2 所示，呈現(xiàn)出裂解性噬菌體特征。噬菌體PPa3、PPa24、PPa27 對40 株銅綠假單胞菌的裂解比例分別是2/40、20/40、15/40。綜合比對3 株噬菌體的裂解活性和裂解譜，最終選定銅綠假單胞菌噬菌體PPa24 作為下一步研究重點。

圖1 雙層瓊脂平板法形成的噬菌斑（PPa24）

圖2 斑點法形成的噬菌斑（PPa24）

3.2 噬菌體的主要生物學特性

3.2.1 噬菌體的微觀形態(tài)噬菌體PPa24 的形態(tài)如圖3 所示，有一個正二十面體頭部，直徑為（75±3）nm，連接長度（220±4）nm 的非可收縮性尾巴。根據(jù)國際病毒分類委員會的分類標準，PPa24 屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae）。

圖3 噬菌體PPa24 的電鏡圖

3.2.2 熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性噬菌體PPa24 的熱穩(wěn)定性如圖4 所示，在35 ℃、45 ℃、55 ℃溫度下作用1 h 仍保持初始滴度，能耐受55 ℃的溫度，熱穩(wěn)定性較高。PPa24 的pH 穩(wěn)定性如圖5 所示，在pH6～10 條件下滴度不變，甚至在pH 值為12 的強堿條件下依然保持一定的活性，說明其對酸堿度的適應范圍較寬。

圖4 噬菌體PPa24 的熱穩(wěn)定性

圖5 噬菌體PPa24 的pH 穩(wěn)定性

3.2.3 最佳感染復數(shù)和一步生長曲線最佳感染復數(shù)測定結(jié)果如表2 所示，噬菌體PPa24 以0.1 的比例擴增時，能產(chǎn)生最高滴度的子代噬菌體，其感染宿主菌的最佳感染復數(shù)為0.1。一步生長曲線如圖6所示，從曲線可知噬菌體PPa24 的潛伏期為20 min，裂解期為70 min，裂解量為62 PFU·cell-1。

表2 噬菌體PPa24 最佳感染復數(shù)的測定結(jié)果

圖6 噬菌體PPa24 的一步生長曲線

3.3 噬菌體的體外抗菌活性

噬菌體PPa24 對宿主菌的體外裂解曲線如圖7所示，宿主菌對照組的OD600值一直處于上升趨勢，菌液逐漸渾濁，而加入噬菌體PPa24 的細菌培養(yǎng)液后，OD600值先保持初始吸光度值，之后有緩和下降的趨勢，肉眼可見菌液逐漸澄清，說明噬菌體PPa24大量裂解培養(yǎng)液中的細菌，有效抑制宿主菌的生長。

圖7 噬菌體PPa24 對宿主菌的裂解曲線

3.4 噬菌體治療小鼠全身感染的效果

腹腔注射最小致死量的菌液（2×109CFU/只）建立小鼠全身感染模型，感染5 h 后，計數(shù)血液載菌量的結(jié)果如圖8 所示，噬菌體治療組PPa24 的血液載菌量相對于模型對照組顯著降低了約3.8 個對數(shù)單位（P＜0.01）。小鼠7 天存活率結(jié)果如圖9 所示，噬菌體治療組PPa24 的存活率顯著提高到75%（P＜0.001），模型對照組小鼠全部死亡，噬菌體對照組小鼠全部存活。

圖8 5 h 后的血液載菌量

圖9 小鼠7 天存活率

4 討論

銅綠假單胞菌的耐藥問題日益嚴重[6]，一方面是由于對多種抗生素固有耐藥，另一方面是存在獲得性耐藥機制，主要包括產(chǎn)生水解酶和主動外排泵等。故迫切需要開發(fā)新的治療手段。噬菌體具有完全不同于抗生素的抗菌機制，控制耐藥菌感染有巨大的應用潛力[7]。

從自然資源中成功分離到一株銅綠假單胞菌噬菌體PPa24，噬菌斑清晰透亮，具有裂解性噬菌體的典型特征，對臨床分離的銅綠假單胞菌的裂解比例為20/40，比文獻[8]報道的銅綠假單胞菌噬菌體的裂解譜更寬（12/27）。PPa24 在35 ℃～55 ℃溫度下和pH6～10 條件下作用1 h 仍能保持較好的抗菌活性，文獻報道的銅綠假單胞菌噬菌體也在60 ℃溫度下基本失活，適宜的酸堿度范圍為pH4～9[9]。PPa24 的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性與文獻報道的基本一致，支持了其在噬菌體治療中儲存和使用的可行性。PPa24 的潛伏期為20 min，裂解量為62，比文獻報道的銅綠假單胞菌噬菌體潛伏期（30 min）更短[10]，裂解量（20）也更大[11]，說明PPa24 裂解宿主菌的速度快且能力強。

噬菌體PPa24 可以明顯降低細菌培養(yǎng)液的OD600值，有效抑制宿主菌的生長，這一結(jié)果與Dong Z 等[12]報道的噬菌體抑制宿主菌在液體培養(yǎng)基中生長的研究結(jié)果相似。PPa24 治療小鼠全身感染可顯著降低血液載菌量，并使小鼠存活率提高至75%，優(yōu)于文獻報道的噬菌體（存活率為40%）的保護作用[13]，也有文獻報道了噬菌體通過不同給藥途徑治療銅綠假單胞菌感染[14]，結(jié)果顯示肌肉注射、皮下注射、腹腔注射的小鼠存活率分別為22%、16%、82%，保護作用最顯著的腹腔注射組與噬菌體PPa24 的體內(nèi)療效相當。

本實驗分離獲得的新型噬菌體PPa24 具有較好的生物學特性，在抗擊銅綠假單胞菌感染方面初步顯示了良好的體內(nèi)外活性，有望成為治療銅綠假單胞菌感染的候選噬菌體。