LC-MS/MS法測定木香檳榔丸中7個(gè)有效成分的含量

伏光耀，張小龍，陳洪巖

1 連云港經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)市場監(jiān)督管理局，連云港 222069;2 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，淮安 223003；3 連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，連云港222006

木香檳榔丸主要由木香、檳榔、枳殼（炒）、陳皮、青皮（醋炒）、香附（醋制）、醋三棱、莪術(shù)（醋炙）、黃連、黃柏（酒炒）、大黃、炒牽牛子、芒硝等13 味中藥制得，可行氣導(dǎo)滯、瀉熱通便，用于治療濕熱內(nèi)停、赤白痢疾、里急后重、胃腸積滯、脘腹脹痛、大便不通等相關(guān)癥狀[1]。該制劑中常見的有效成分有去氫木香內(nèi)酯、α-香附酮、氫溴酸檳榔堿、鹽酸小檗堿、橙皮苷、大黃素、大黃酚等。這些成分對人體有重要的藥理作用。目前，《中國藥典》2020 年版一部對木香檳榔丸的質(zhì)量控制僅用薄層色譜法鑒別，并沒有相關(guān)有效成分的含量控制。在文獻(xiàn)報(bào)道中，有對木香檳榔丸中枳殼的質(zhì)量控制，主要采用高效液相色譜法對枳殼中的橙皮苷的含量測定，或者對木香檳榔丸中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測定[1～3]。對上述提到的木香檳榔丸中7個(gè)常見有效成分只測定其中一種或者兩種成分[4～6]，而未見對上述7 個(gè)成分同時(shí)測定的報(bào)道。本文同時(shí)測定了木香檳榔丸7 個(gè)成分的含量，完善了木香檳榔丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

LC-30 超高效液相色譜儀（包括SIL-30A 型自動進(jìn)樣器、LC-30AD 二元輸液泵、真空脫氣機(jī)、CTO-30A 柱溫箱），日本島津公司；QTRAP 5500 型三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB Sciex 公司；AG135 型十萬分之一電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Agilent1260Infinity HPLC（配備DAD 檢測器、二元泵系統(tǒng)、高通量自動進(jìn)樣器）；Agilent-Mass QTOF（電噴霧離子源、正負(fù)離子模式）。

1.2 藥品與試劑

對照品：去氫木香內(nèi)酯（批號：111525-201912，純度99.5%）、α-香附酮（批號：110748-202016，純度99.4%）、氫溴酸檳榔堿（批號：111684-202003，純度99.8%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-202015，純度85.9%）、橙皮苷（批號：1110721-202019，純度95.3%）、大黃素（批號：110756-201913，純度96.0%）、大黃酚（批號：110796-201922，純度99.4%）均由中國食品藥品檢定研究院提供。供試品：木香檳榔丸（廠家提供，批號：18081488、18071871、19051395）。

甲醇、乙腈、乙醇、甲酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈流動相B（按表1 進(jìn)行梯度洗脫）；柱溫：30 ℃；流速：0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源（ESI）；正負(fù)離子模式；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細(xì)管電壓為5500 V（正離子模式）、-4500 V（負(fù)離子模式），脫溶劑溫度為550 ℃，氣簾氣壓力為35 psi，霧化器與干燥氣的壓力均為55 psi；離子源所用氮?dú)饧兌取?5%，碰撞氣純度≥99.999。7 個(gè)待測組分的離子對質(zhì)譜優(yōu)化條件見表2。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取氫溴酸檳榔堿、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯、鹽酸小檗堿、橙皮苷、大黃素、大黃酚對照品適量，分別置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，制備成濃度分別為209.6、190.4、208.0、182.3、133.1、135.6、211.9 μg·mL-1的儲備液。

精密吸取上述7 個(gè)成分的對照品儲備液各1.0mL，置于同一200 mL 的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得混合對照品溶液Ⅰ。再精密吸取混合對照品溶液I 為5mL，置10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL 分別含有上述成分524.0、476.0、520.0、455.8、332.8、339.0、529.8ng 的混合對照溶液Ⅱ。

2.4 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，精密稱取約1.0 g，置150 mL的燒瓶中，用移液管精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，回流處理1.5 h，室溫放置，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量中，搖勻，離心，取上清液。精密吸取上清液1 mL 置20 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上清液1 mL 置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 陰性對照試驗(yàn)

按照木香檳榔丸處方[1]，制成只含醋三棱、莪術(shù)（醋炙）、炒牽牛子的陰性對照樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。精密量取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各1 μL，進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對照品溶液及供試品提取離子流色譜圖

圖2 陰性對照總離子流色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對照品溶液Ⅰ適量，用甲醇稀釋，配制成氫溴酸檳榔堿濃度為1048、524.0、104.8、52.40、26.20、10.48 ng·mL-1，α-香附酮濃度為952.0、476.0、95.20、47.60、23.80、9.520 ng·mL-1，去氫木香內(nèi)酯濃度為1040、520.0、104.0、52.00、26.00、10.40 ng·mL-1，鹽酸小檗堿濃度為911.5、455.8、91.16、45.58、22.79、9.116 ng·mL-1，橙皮苷濃度為665.5、332.8、66.56、33.28、16.64、6.656 ng·mL-1，大黃素為678.0、339.0、67.80、33.90、16.95、6.780 ng·mL-1，大黃酚為1060、530.0、106.0、53.00、26.50、10.60 ng·mL-1的系列溶液，進(jìn)樣測定其峰面積。以對照品濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，各對照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，結(jié)果見表3。

表3 線性回歸方程與范圍

2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液Ⅱ，精密吸取1 μL，按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下檢測條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果氫溴酸檳榔堿、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯、鹽酸小檗堿、橙皮苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD（n=6）分別為0.88%、1.95%、2.22%、0.40%、3.39%、1.44%、0.95%

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取“2.4”項(xiàng)下供試品溶液（批號：18081488）適量，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h，進(jìn)樣檢測，結(jié)果氫溴酸檳榔堿、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯、鹽酸小檗堿、橙皮苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD（n=6）分別為3.52%、1.89%、2.56%、2.17%、2.69%、1.45%、2.93%。

結(jié)果表明，供試品溶液中待測組分在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品適量（批號：18081488）共6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果氫溴酸檳榔堿、α-香附酮、去氫木香內(nèi)酯、鹽酸小檗堿、橙皮苷、大黃素、大黃酚平均含量分別為336.6、141.6、590.0、6356、2179、1108、962.1 μg·g-1，RSD 分別2.43%、1.25%、2.76%、0.87%、0.25%、0.97%、3.04%（n=6）。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一樣品（批號：18081488）約0.5 g，共6 份，精密稱定，分別精密加入各對照品儲備液適量，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣，以樣品稱樣量乘以各待測成分的平均含量，得到加標(biāo)前原樣品中各待測成分的含有量（以g 計(jì)），即基礎(chǔ)值。

將圖譜中得到的各待測成分色譜峰的峰面積代入其線性方程，計(jì)算得到供試品溶液中各待測成分的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出加標(biāo)后樣品中各待測成分的含有量（以g 計(jì)），即實(shí)測值。

將對照品儲備液濃度乘以加標(biāo)體積作為加標(biāo)值（以g 計(jì)），以（實(shí)測值-基礎(chǔ)值）/加標(biāo)值100%計(jì)算各待測成分的回收率。結(jié)果表明，氫溴酸檳榔堿平均回收率為101.46%，RSD 為2.31%（n=6）；α-香附酮平均回收率為99.81%，RSD 為2.50%（n=6）；去氫木香內(nèi)酯平均回收率為100.27%，RSD 為1.95%（n=6）；鹽酸小檗堿平均回收率為97.94%，RSD 為1.47%（n=6）；橙皮苷平均回收率為98.74%，RSD 為2.13%（n=6）；大黃素平均回收率為99.17%，RSD 為3.33%（n=6）；大黃酚平均回收率為100.18%，RSD為1.85%（n=6）。

2.11 樣品含量測定

取3 批木香檳榔丸樣品各適量，按“2.4”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，再按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣，將供試品圖譜中得到的各待測成分色譜峰的峰面積代入其線性方程，計(jì)算得到供試品溶液中各待測成分的濃度C，以濃度C 稀釋倍數(shù)/（稱樣量×1000）計(jì)算樣品各待測成分的含量（平行制備6 份樣品，含量以6 份平行樣品的平均含量計(jì)）。結(jié)果見表4。

表4 3 批樣品含量測定結(jié)果（n=6，μg·g-1）

3 討論

由于大黃素、大黃酚的[M+H]+峰響應(yīng)均不是很高，且有大黃素、大黃酚在負(fù)離子模式下測定的文獻(xiàn)報(bào)道[7，8]，本研究采用負(fù)離子模式測定樣品中大黃素、大黃酚的含量。通過實(shí)驗(yàn)可知，大黃素、大黃酚的[M-H]-峰響應(yīng)較高，故確定其采用負(fù)離子模式測定。

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙醇、50%甲醇作為提取溶劑，分別用超聲法、回流法（0.5、1、1.5、2 h）、研磨法提取樣品，結(jié)果表明，采用50%甲醇作溶劑，回流1.5h效果良好，可將待測組分提取完全且操作簡便。