HPLC法測定磷酸替米考星可溶性粉中有關(guān)物質(zhì)的研究

馬春芳，李 敏，吳春燕，張 雯，鄧亞婷，陳建蓉，王 旗，余永濤，楊 奇*

(1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750011；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

磷酸替米考星可溶性粉是替米考星原料藥與磷酸溶液發(fā)生成鹽反應(yīng)與無水葡萄糖或乳糖等混合后制成可溶性粉制劑，為國家三類新獸藥，屬大環(huán)內(nèi)酯類類畜禽專用廣譜抗生素[1]，對革蘭氏陽性菌和一些革蘭氏陰性菌及支原體等有很強(qiáng)的抑菌作用[2-3]，主要用于治療敏感性細(xì)菌引起的消化道、呼吸道疾病[4-5]。其克服了替米考星不溶于水、生物利用度低、不方便臨床用藥等問題，是安全有效治療家畜呼吸系統(tǒng)疾病的一類獸藥。目前，關(guān)于磷酸替米考星可溶性粉藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)[6]的報(bào)道較多，冷曉紅等[7]就磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量做了研究，針對其有關(guān)物質(zhì)測定的研究尚無報(bào)道，僅農(nóng)業(yè)部2172號[8]、2270號[9]、2440號[10]、2455號[11]公告對磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其檢測方法作了規(guī)定，4個(gè)公告中有關(guān)物質(zhì)檢測方法中供試品處理方法、梯度洗脫比例，規(guī)定的單個(gè)雜質(zhì)及各雜質(zhì)和的限度均不同，為實(shí)際檢測工作帶來不便，所以有必要建立一套專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好的有關(guān)物質(zhì)檢查法，有效控制磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量。

本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)(國家)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂的要求，并參考《中國獸藥典》[12]中替米考星原料藥的雜質(zhì)限度要求(其雜質(zhì)均為未知雜質(zhì))，針對磷酸替米考星可溶性粉有關(guān)物質(zhì)檢測方法進(jìn)行修訂完善，研究了磷酸替米考星可溶性粉中有關(guān)物質(zhì)測定的HPLC法，并對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和系統(tǒng)適用性研究，提出系統(tǒng)適用性要求，建立專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確靈敏的檢測方法，使其能夠滿足國家質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求和實(shí)際檢測工作的需求，能夠應(yīng)用于磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制。本研究將為確保獸藥產(chǎn)品質(zhì)量安全，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測的穩(wěn)定性和可靠性，進(jìn)一步完善國家獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供重要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品(含量95.3%，批號K0311805)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號1803001、1803002、1803003，規(guī)格均為10%)，山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號20180101、20180102、20180103，規(guī)格均為10%)，廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司保健品廠產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號F83190503，規(guī)格為10%)，寧夏泰瑞制藥股份有限公司產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號18012301、18012302、1802303，規(guī)格均為10%)，河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

乙腈(色譜級，批號172290)，F(xiàn)ishow chemical公司產(chǎn)品；磷酸(優(yōu)級純，批號20170216)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；四氫呋喃(色譜級，批號20180206)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；正二丁胺(化學(xué)純，批號20180303)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Agilent1100、Agilent1260 Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平(十萬分之一)、F28-pH計(jì)，德國梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；KQ-250B型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；ZB8/AKF-3水分測定儀，瑞士萬通公司產(chǎn)品；DZF-6090減壓干燥箱，上海旌派科技有限公司產(chǎn)品；Direct-Q 8超純水儀，德國默克密理博公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，邊加邊攪拌，冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5±0.1，加水至100 mL)(975∶25)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫(表1)；檢測波長為280 nm，流速為1.1 mL/min。

表1 梯度洗脫比例

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加乙腈定量稀釋配制成每1 mL中含0.25 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取磷酸替米考星可溶性粉適量(約相當(dāng)于替米考星0.2 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加磷酸溶液適量，加乙腈10 mL，超聲使溶解，并用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)測定的供試品溶液。

1.2.2.3 系統(tǒng)適用性 精密量取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。

1.2.2.4 方法精密度 精密稱取2.000 g磷酸替米考星可溶性粉 6份，置50 mL容量瓶中，加磷酸稀釋液適量，加乙腈10 mL，超聲使溶解，再用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取各溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2.5 專屬性考察

(1)干擾試驗(yàn) 分別取溶劑空白、輔料空白(0.05 mol/L磷酸、葡萄糖、乳糖)、供試品和替米考星對照品，按有關(guān)測定項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

(2)破壞性試驗(yàn) 取磷酸替米考星可溶性粉作供試品進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，經(jīng)過高溫、強(qiáng)光、酸度、堿度、氧化等破壞，檢測有關(guān)物質(zhì)是否發(fā)生變化、降解。稱取5份磷酸替米考星可溶性粉2.000 g，同時(shí)稱輔料空白，分別做105℃高溫破壞、4 000 lx強(qiáng)光破壞、1 mol/L鹽酸溶液強(qiáng)酸性破壞、1 mol/L氫氧化鈉溶液強(qiáng)堿性破壞、加入30 mL/L過氧化氫溶液1 mL做氧化破壞試驗(yàn)，按照供試品溶液配制的方法，將破壞過的磷酸替米考星可溶性粉進(jìn)行樣品前處理，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析，記錄雜質(zhì)變化。

1.2.2.6 檢測限 配制不同濃度的替米考星對照品溶液，濃度為0.04、0.05、0.06 mg/mL，以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度為檢測限。

1.2.2.7 溶液穩(wěn)定性 將配置的有關(guān)物質(zhì)的供試品溶液分別放置0、4、6、10、16、24、36 h后進(jìn)樣測定有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)峰面積變化。

1.2.2.8 耐用性 通過改變柱溫、流速以及不同品牌的色譜柱對色譜條件進(jìn)行微調(diào)，檢測磷酸替米考星可溶性粉在不同色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果變化，考察其方法的可行性。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

由表2可知，有關(guān)物質(zhì)測定的理論塔板數(shù)最大為30 467，最小為28 221；反式異構(gòu)體保留時(shí)間均在9.5 min，順式異構(gòu)體保留時(shí)間為10.1 min，峰面積的含量均在范圍內(nèi)，峰面積RSD均小于2.0%，保留時(shí)間RSD均小于1.0%；替米考星反式異構(gòu)體峰、順式異構(gòu)體峰與順-8-差向異構(gòu)體的相對保留時(shí)間分別為0.9、1.0、1.1 min。

表2 有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 方法精密度結(jié)果 有關(guān)物質(zhì)方法精密度結(jié)果見表3。單個(gè)雜質(zhì)平均為1.25%，各雜質(zhì)的和平均值為5.65%，符合獸藥典中規(guī)定的樣品待測成分為1%～10%范圍要求，RSD可接受范圍為3.5%，計(jì)算6次測試的磷酸替米考星可溶性粉中單個(gè)雜質(zhì)和各雜質(zhì)的和的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.33%和0.51%。

表3 方法精密度結(jié)果

2.2.2 干擾試驗(yàn) 專屬性試驗(yàn)結(jié)果如圖1～圖6所示。溶劑空白、輔料空白對磷酸替米考星可溶性粉有關(guān)物質(zhì)色譜峰均無干擾，有關(guān)物質(zhì)色譜峰顯示供試品反式異構(gòu)體的兩個(gè)不完全分離的峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.05 %；供試品色譜圖中分離的主峰和已知雜質(zhì)與潛在雜質(zhì)的可接受標(biāo)準(zhǔn)為主峰與各雜質(zhì)峰之間分離度大于1.5 。

圖1 溶劑空白-乙腈+磷酸溶液色譜圖

2.2.3 破壞性試驗(yàn)結(jié)果 破壞性試驗(yàn)結(jié)果見表4，由表4可知，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫等劇烈條件下，對供試品進(jìn)行破壞。溶劑空白、輔料空白未產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，且不干擾有關(guān)物質(zhì)檢測。供試品對光照、高溫、氧化等條件變化測定的結(jié)果比較穩(wěn)定，單個(gè)雜質(zhì)與各雜質(zhì)的和均在3.0%和9.0%限度范圍內(nèi)，有關(guān)物質(zhì)未發(fā)生明顯變化。

圖2 輔料空白-磷酸溶液色譜圖

圖3 輔料-乳糖色譜圖

圖4 輔料-葡萄糖色譜圖

圖5 對照品色譜圖

圖6 供試品色譜圖

表4 有關(guān)物質(zhì)破壞性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 定量限與檢出限 按照有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下方法，配制濃度為0.04、0.05、0.06 mg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度測得有關(guān)物質(zhì)的檢測限，為0.1 μg/mL，信噪比10∶1時(shí)的濃度定量限為0.4 μg/mL。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。磷酸替米考星可溶性粉溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，雜質(zhì)峰面積未發(fā)生明顯變化，RSD為1.2%，小于2.0%；24 h～36 h色譜峰面積增大，峰型增寬，雜質(zhì)峰增多，溶液不穩(wěn)定，RSD大于2.0%。

2.2.6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果 如表5結(jié)果顯示，采用島津Intertsustain C18色譜柱時(shí)，替米考星反式異構(gòu)體未能出現(xiàn)兩個(gè)不完全分離的峰，分離度達(dá)不到要求。使用Aiglent ZORBA*SB C18150*4.6 mm 5 μm色譜柱時(shí)，有關(guān)物質(zhì)測定梯度洗脫時(shí)間較長，該色譜柱較短，不能滿足梯度洗脫比例變化要求，不出現(xiàn)色譜峰。采用Waters C18 5 μm 250*4.6 mm柱或Aiglent C18 250*4.6 mm柱時(shí)，分離度分別為2.45和2.32；柱溫在20、25、30℃檢測有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果均一致；流速進(jìn)行微調(diào)測定無明顯變化，理論塔板數(shù)按順式替米考星計(jì)算均不低于3 000，分離度均大于1.5，表明方法耐用性良好。

表5 有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品測定

擬定方法下測得4家企業(yè)11批樣品，其單個(gè)雜質(zhì)均小于3.0%；樣品各雜質(zhì)的和均小于9.0%，符合規(guī)定(表6)。

表6 有關(guān)物質(zhì)測定雜質(zhì)檢測結(jié)果

3 討論

農(nóng)業(yè)部4個(gè)公告中流動(dòng)相組成一致，均以水-磷酸二丁胺溶液=975∶25為流動(dòng)相A；以乙腈為流動(dòng)相B，但梯度洗脫的比例不一致，2172、2455號公告的流動(dòng)相比例下樣品中替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開的峰不明顯；2270、2440號公告流動(dòng)相比例下，替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開的峰明顯出現(xiàn)，但2440號公告主峰保留時(shí)間與2270號公告相比，有所推遲；本研究選擇與《中國獸藥典》2015版中替米考星有關(guān)物質(zhì)測定項(xiàng)下的洗脫比例，替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開的峰明顯出現(xiàn)。

有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果表明，使用Aiglent ZORBA*SB C18250*4.6 mm色譜柱和Waters symmetry@ C18 250*4.6 mm色譜柱，反式異構(gòu)體均出現(xiàn)兩個(gè)不完全分離的2個(gè)峰。測得替米考星反式異構(gòu)體和順式異構(gòu)體峰的分離度分別為2.41和2.45，分離度符合要求。所以在對磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)測定時(shí)，建議最好選用Aiglent 或WatersC18 250*4.6 mm色譜柱。

本研究通過對磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)測定的高效液相色譜方法的系統(tǒng)適應(yīng)性研究，有關(guān)物質(zhì)檢測并與《中國獸藥典》(2015版)和農(nóng)業(yè)部4個(gè)公告對比，顯示在該色譜條件下，對樣品進(jìn)行破壞檢測均無干擾，方法專屬性強(qiáng)；測定的樣品相鄰色譜峰之間的分離度高，對磷酸替米考星可溶性粉高效液相色譜檢測方法的色譜條件進(jìn)行微調(diào)，測定結(jié)果一致，方法耐用性強(qiáng)。本法可用于對磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)的限度測定。