烏魯木齊市寵物源糞腸球菌和屎腸球菌耐藥性及耐藥基因檢測

宋超慧，軒慧勇，吾買爾江·牙合甫，秦 蕾，徐琦琦，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

腸球菌是革蘭氏陽性球菌，可定殖于人和動物的腸道，屬于機會致病菌。糞腸球菌和屎腸球菌是其主要種類[1]，它們可引起人和動物的多種感染，而毒力基因和生物膜的形成，可增加腸球菌的致病性[2]。此外，腸球菌能引起犬、貓、食品動物繼發(fā)感染[3-5]。由于臨床上人和寵物經(jīng)常使用相似的抗菌藥物進行治療，人與寵物的密切接觸存在抗藥性細菌轉(zhuǎn)移的風險[6]。糞腸球菌經(jīng)常被報道為致病性或潛在致病性細菌的抗藥性基因貯藏庫[7]，在醫(yī)院臨床病例中分離得到的腸球菌多藥耐藥現(xiàn)象嚴重[8]，對新型抗菌藥物利奈唑胺的耐藥性和耐藥基因optrA的檢出率呈上升趨勢[9]。由于人和寵物的密切接觸，了解寵物腸球菌的耐藥情況及可能攜帶的相關耐藥基因有助于評估細菌耐藥性向人類傳播的潛在風險。本文通過對新疆烏魯木齊市寵物源糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥性及相關耐藥基因流行情況調(diào)查，為寵物臨床合理用藥提供參考，以期減少耐藥菌株的產(chǎn)生，同時也為寵物源腸球菌耐藥性監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2019年9月于新疆烏魯木齊市寵物醫(yī)院、警犬基地、犬養(yǎng)殖基地采集犬和/或貓的肛拭子樣品449份，從中分離試驗用糞腸球菌和屎腸球菌。

1.1.2 試劑與抗菌藥物 BHI培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、腸球菌選擇培養(yǎng)基，奧博星生物技術有限公司(北京)產(chǎn)品；PCR反應體系試劑，天根生化科技有限公司(北京)產(chǎn)品；慶大霉素(gentamicin，GEN)、阿米卡星(amikacin，AMK)、恩諾沙星(enrofloxacin，EN)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、阿莫西林/克拉維酸(amoxicillin/Clavulanic Acid，A/C)、氨芐西林(ampicillin，AMP)、亞胺培南(imipenem，IPM)、四環(huán)素(tetracycline，TET)、萬古霉素(vancomycin，VAN)、利奈唑胺(linezolid，LNZ)抗菌藥物，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設備 電熱恒溫培養(yǎng)箱(DG-70D)，成都紅星電燃廠產(chǎn)品；PCR擴增儀(YK1125511)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸蛋白測定儀(Bio Photometer plus)、高速冷凍離心機(5415R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳成套設備(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(JS-780)，上海培清科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)文獻[10]已有序列合成屎腸球菌和糞腸球菌持家基因引物；根據(jù)文獻[11-18]已有序列合成待檢耐藥基因引物，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列及片段大小

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將采集的樣品置于滅菌的65 g/L氯化鈉BHI肉湯中，42℃、200 r/min培養(yǎng)18 h～24 h，用無菌一次性接種環(huán)蘸取菌液劃線于腸球菌培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)18 h～24 h，平板表面呈白色圓滑、凸起、大小適中且菌落周圍顯黑色的單一菌落，可初步鑒定為腸球菌，挑取單菌落保存?zhèn)溆?。菌落純化后，進行腸球菌菌種鑒定。

1.2.2 菌種鑒定 通過水煮法提取細菌DNA模板，采用PCR方法對屎腸球菌和糞腸球菌持家基因進行擴增，擴增產(chǎn)物送測序。測序結果經(jīng)BLAST序列比對，陽性菌株用滅菌的600 mL/L甘油保菌，置-20℃保存。

1.2.3 藥敏試驗 按美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的瓊脂稀釋法進行，對分離鑒定出的糞腸球菌和屎腸球菌進行氨基糖苷類(慶大霉素、阿米卡星)、β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林)、喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星)、四環(huán)素類(四環(huán)素)、碳青霉烯類(亞胺培南)、糖肽類(萬古霉素)、噁唑烷酮類(利奈唑胺)共7大類10種抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測定。標準質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213、糞腸球菌ATCC 29212，藥敏試驗結果以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)3種形式表示。

1.2.4 耐藥基因檢測 利用PCR和測序技術對腸球菌進行以下耐藥基因檢測，包括氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(4′-4″)；四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetC、tetM；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M；糖肽類耐藥基因VanA、VanB；噁唑烷酮類耐藥基因optrA。引物序列見表1。

2 結果

2.1 腸球菌分離鑒定結果

經(jīng)分離鑒定出寵物源糞腸球菌和屎腸球菌共計123株(123/449，27.4%)，其中糞腸球菌81株(81/123，65.9%)，包括犬糞腸球菌73株(73/81，90.1%)和貓糞腸球菌8株(8/81，9.9%)；屎腸球菌42株(42/123，34.1%)，包括犬屎腸球菌35株(35/42，83.3%)和貓屎腸球菌7株(7/42，16.7%)。部分PCR鑒定結果見圖1。

A.糞腸球菌基因擴增結果；B.屎腸球菌基因擴增結果M.DNA標準DL 2 000；+.陽性；-.陰性；1～5.試驗菌株A.Amplification results of E.faecalis gene; B.Amplification results of E.faecium geneM.DNA Marker DL 2 000; +.Positive control; -.Negative control; 1-5.Tested strains

2.2 糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥結果

糞腸球菌與屎腸球菌耐藥結果顯示，糞腸球菌對被檢藥物中的5種有耐藥菌株檢出，對慶大霉素(51.9%)和四環(huán)素(81.5%)的耐藥率較高，對其他被檢抗菌藥物的耐藥率分布在2.5%～17.3%；屎腸球菌對被檢藥物中的6種有耐藥菌株檢出，對四環(huán)素耐藥率較高(73.8%)，而對其他被檢抗菌藥物的耐藥率分布在7.1%～21.4%；整體而言，屎腸球菌的耐藥情況較糞腸球菌稍嚴重，糞腸球菌與屎腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、萬古霉素以及利奈唑胺高度敏感，結果詳見表2。

表2 糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥結果

2.3 糞腸球菌與屎腸球菌的多藥耐藥及耐藥譜型結果

圖2為糞腸球菌與屎腸球菌的多藥耐藥結果，屎腸球菌和糞腸球菌多藥耐藥主要分布在0～3耐，其中糞腸球菌以2耐最高，多藥耐藥率達35.8%；屎腸球菌以1耐最高，多藥耐藥率達40.5%，6耐分布有1株屎腸球菌。

圖2 糞腸球菌與屎腸球菌多藥耐藥結果

耐藥譜型結果顯示，123株腸球菌共檢出14種耐藥譜型。其中，糞腸球菌共有8種耐藥譜型，以1耐、2耐和3耐譜型為主，1耐譜型中以GEN為主，占29.6%(24/81)；2耐譜型中以GEN+TET為主，占33.3%(27/81)；3耐譜型中以GEN+AMK+TET為主，占16.0%(13/81)。屎腸球菌共有13種耐藥譜型，以1耐和3耐譜型為主，1耐譜型中以TET為主，占31.0%(13/42)；3耐譜型中以GEN+AMK+TET為主，占16.7%(7/42)。1株6耐菌株的譜型為GEN+ENO+AMK+TET+IPM+CIP。

2.4 犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥性差異

結果詳見表3。犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌對抗菌藥物的耐藥結果顯示，犬源和貓源糞球菌耐藥譜相同，均對10種被檢藥物中的5種藥物耐藥，對慶大霉素的耐藥率均超過50%(犬：50.7%；貓：62.5%)、對四環(huán)素的耐藥率均超過75.0%(犬：79.5%；貓：100%)，且貓源糞腸球菌耐藥率均高于犬源糞腸球菌；犬源屎腸球菌對恩諾沙星(17.1%)、環(huán)丙沙星(20.0%)和四環(huán)素(74.3%)的耐藥率高于貓源屎腸球菌，貓源屎腸球菌對慶大霉素(57.1%)、阿米卡星(42.9%)和亞胺培南(14.3%)的耐藥率高于犬源屎腸球菌；犬、貓源糞腸球菌對亞胺培南高度敏感，貓源屎腸球菌對恩諾沙星高度敏感，同時犬、貓源糞腸球菌和屎腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、萬古霉素以及利奈唑胺也保持高度敏感，無耐藥菌株檢出。

表3 犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌耐藥率

2.5 犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌的多藥耐藥及耐藥譜型結果

圖3為犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌的多藥耐藥結果，多藥耐藥結果主要分布在0～3耐。犬糞腸球菌和屎腸球菌以1耐、2耐為主，貓糞腸球菌和屎腸球菌以2耐和3耐為主；其中1耐分布的犬糞腸球菌(31.5%)和屎腸球菌(41.9%)均高于貓糞腸球菌(25.0%)和屎腸球菌(28.6%)；2耐分布的貓糞腸球菌(37.5%)略高于犬糞腸球菌(35.6%)，未檢出2耐貓屎腸球菌；3耐分布的貓糞腸球菌(37.5%)和屎腸球菌(57.1%)均高于犬糞腸球菌(16.4%)和屎腸球菌(17.1%)；6耐分布1株犬屎腸球菌。

圖3 犬、貓源糞腸球菌和屎腸球菌多藥耐藥結果

耐藥譜型結果顯示犬糞腸球菌共有7種耐藥譜型，以1耐、2耐和3耐譜型為主，1耐譜型中以TET為主，占30.1%(22/73)，2耐譜型中以GEN+TET為主，占32.9%(24/73)，3耐譜型中以GEN+AMK+TET為主，占15.1%(11/73)；犬屎腸球菌共有10種耐藥譜型，以1耐分布最多，1耐譜型中以TET為主，占34.3%(12/35)。貓糞腸球菌共檢出4種耐藥譜型，以2耐為主，占37.5%(3/8)，2耐譜型中以GEN+TET為主；貓屎腸球菌共檢出4種耐藥譜型，以3耐為主，占42.9%(3/7)，3耐譜型中以GEN+AMK+TET為主；1株6耐菌株為犬屎腸球菌。

2.6 犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌耐藥基因的檢測結果

檢測結果詳見表4。對不同來源耐藥糞腸球菌與耐藥屎腸球菌進行11種耐藥基因的檢測結果顯示，犬、貓糞腸球菌和屎腸球菌檢出的氨基糖苷類耐藥基因均以aac(6′)/aph(2″)和aph(3′)-Ⅲ為主；四環(huán)素耐藥基因以tetM為主，tetA基因僅在犬糞腸球菌(1.4%)和屎腸球菌(2.9%)中檢出；犬糞腸球菌和屎腸球菌檢出噁唑烷酮類耐藥基因optrA，檢出率分別為2.7%和8.6%。耐藥基因ant(4′-4″)、tetC、blaTEM、blaCTX-M、VanA、VanB未檢出。

表4 犬、貓源糞腸球菌與屎腸球菌耐藥基因檢出率

3 討論

腸球菌由于自身細胞壁堅厚，對許多抗菌藥物表現(xiàn)為固有耐藥[19-20]，如對青霉素類、頭孢菌素類、低濃度氨基糖苷類、紅霉素和復方新諾明。通過突變株的發(fā)生、質(zhì)粒交換以及轉(zhuǎn)座子編碼的耐藥基因，腸球菌對許多抗菌藥物產(chǎn)生獲得性耐藥，如高水平耐β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、糖肽類、四環(huán)素、紅霉素。由于腸球菌存在于人和動物腸道以及自然環(huán)境，耐藥株的存在可增強其耐藥性在三者之間傳播的風險。人與寵物可以密切接觸，更應加強腸球菌耐藥性監(jiān)測，評估細菌耐藥性向人類傳播的潛在風險，避免危害公眾健康事件的發(fā)生。

分離鑒定出的寵物源糞腸球菌和屎腸球菌，對被檢抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥。寵物源糞腸球菌和屎腸球菌對四環(huán)素耐藥率較高，對喹諾酮類藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星耐藥率較低，且屎腸球菌的耐藥率略高于糞腸球菌，這與國內(nèi)外部分報道結果一致[6,21-22]。對慶大霉素產(chǎn)生耐藥性的腸球菌菌株應引起重視，避免產(chǎn)生對慶大霉素高水平耐藥的腸球菌，因為它會導致氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類或糖肽抗生素的協(xié)同殺菌作用喪失[23]。寵物源腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、萬古霉素完全敏感，對亞胺培南高度敏感，這與Rodrigues J L等[1]研究結果一致，未發(fā)現(xiàn)噁唑烷酮類耐藥菌株。據(jù)Van Den Bunt G等[24]所述,今后應繼續(xù)監(jiān)測寵物源腸球菌的耐藥性，避免耐氨芐青霉素的屎腸球菌和耐萬古霉素的菌株產(chǎn)生。犬、貓源腸球菌的耐藥率存在不同，可能與樣品采集動物的種類、年齡、體重、性別及健康狀況的差異有關，即使同為犬或貓，機體對不同藥物的吸收和排泄也存在差異，導致用同一種藥物治療后結果不同[25]。雖然腸球菌具有宿主特異性，但Jackson C R等[26]發(fā)現(xiàn)，部分犬、貓源腸球菌具有非常相似的PFGE模式，腸球菌菌株包含多種耐藥基因組合且遺傳關系密切，有可能在犬和貓之間交換。此外，在健康的犬和貓源腸球菌中發(fā)現(xiàn)攜帶在人源腸球菌中檢出的抗性基因，Jackson C R等認為健康的犬、貓源腸球菌可能是抗菌藥物耐藥基因的儲存庫，存在從寵物轉(zhuǎn)移到人和環(huán)境中的風險。因此，寵物臨床應正確選擇抗菌藥物，合理用藥。

根據(jù)耐藥基因檢測結果發(fā)現(xiàn)貓源腸球菌攜帶的耐藥基因型較少，以同時攜帶aac(6′)/aph(2″)+aph(3′)-Ⅲ+tetM耐藥基因為主。犬源腸球菌耐藥基因型多，犬源糞腸球菌以同時攜帶aac(6′)/aph(2″)+aph(3′)-Ⅲ+tetM耐藥基因為主；犬屎腸球菌以攜帶tetM耐藥基因為主，與Jackson C R等[26]報道的美國犬、貓中檢測出的部分耐藥基因結果相同。寵物源腸球菌耐藥基因型與耐藥表型基本保持一致，利奈唑胺作為一種新型抗菌藥物，是目前公認為治療革蘭氏陽性菌最有效的藥物，但在本研究中對該藥表現(xiàn)為中介的犬源腸球菌菌株中檢出攜帶optrA基因，這提示optrA基因有加速細菌耐藥性的風險，應加強監(jiān)測避免耐藥菌株的產(chǎn)生和其在人與寵物之間傳播的可能；部分耐藥菌株未檢出耐藥基因，如對亞胺培南耐藥的菌株未檢出耐藥基因，分析耐藥株的產(chǎn)生可能還與毒力基因有一定關系，Rathnayake I U等[27]在比較臨床和環(huán)境中分離得到的糞腸球菌和屎腸球菌的毒力和抗生素耐藥性關系時發(fā)現(xiàn)，帶有毒力基因的糞腸球菌和屎腸球菌分離株也都含有抗生素抗性決定簇，毒力基因的存在與抗生素抗性之間顯著相關。而關于攜帶毒力基因與耐藥表型之間的關系還需繼續(xù)研究。

綜上所述，新疆烏魯木齊市寵物源糞腸球菌與屎腸球菌存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，且糞腸球菌與屎腸球菌耐藥性存在不同；菌株對四環(huán)素類藥物耐藥最為嚴重且相關耐藥基因檢出率最高，耐藥基因型豐富。故在寵物臨床治療中，建議根據(jù)耐藥性結果進行合理用藥，持續(xù)加強對寵物源腸球菌耐藥性監(jiān)測。