福美雙對肉雞股骨生長發(fā)育的影響及巴戟天多糖保護(hù)效果的研究

曹芹芹，岳 珂，林露茜，徐婷婷，張朝棟，鄭晶晶，孔安安，仝宗喜，黃淑成

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

福美雙是一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的殺菌劑。研究表明，福美雙在飼料中的殘留會對家禽的生長發(fā)育造成不良影響， 尤其對骨骼發(fā)育的影響較為嚴(yán)重，可導(dǎo)致骨骼畸形或骨骼虛弱，引起家禽不同程度的跛行，嚴(yán)重威脅動物福利，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。

巴戟天多糖 （Morinda officinalis polysaccharide，MOP）是中藥巴戟天的主要活性成分之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)壯骨骼、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等多種功效［3-6］。賴滿香等［7］研究表明MOP 能提高堿性磷酸酶的活性并促進(jìn)骨骼礦化， 從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。 鑒于MOP 對動物骨骼生長發(fā)育的作用，其在預(yù)防和治療肉雞骨骼生長發(fā)育疾病方面具有一定的潛力。

該試驗(yàn)以艾拔益加肉雞（AA 肉雞）為研究對象，采用股骨形態(tài)與指數(shù)評估、股骨灰分檢測、生化指標(biāo)檢測等方法， 通過考查股骨的強(qiáng)度和骨量以及鈣磷沉積代謝水平， 探究福美雙對肉雞骨骼生長發(fā)育的影響，并評價MOP 對由福美雙誘導(dǎo)的肉雞骨骼生長發(fā)育不良的保護(hù)效果， 為生產(chǎn)實(shí)踐中預(yù)防和治療由福美雙引起的禽類骨骼生長發(fā)育不良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)所用300 只1 日齡AA 肉雞購于河南省開封市興達(dá)禽業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 藥品、試劑及主要儀器設(shè)備

MOP（批號：CY180812），購自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；福美雙（二硫化四甲基秋蘭姆），購于上海麥克林生物化學(xué)有限公司； 鈣測試盒 （貨號：C004-2-1）、無機(jī)磷測試盒（貨號：C006-1-1），購自南京建成生物工程研究所； 研缽、 分光光度計、坩堝、電爐、數(shù)顯式肌肉嫩度儀。

1.3 試驗(yàn)分組及處理

將300 只AA 肉雞隨機(jī)分為5 組，包括：對照組，飼喂正常日糧；福美雙組，飼喂正常日糧+日糧中添加50 mg/kg 福美雙；低劑量MOP 組，飼喂正常日糧+日糧中添加50 mg/kg 福美雙+飲水中添加250 mg/L MOP；中劑量MOP 組，飼喂正常日糧+日糧中添加50 mg/kg 福美雙+飲水中添加500 mg/L MOP；高劑量MOP 組，飼喂正常日糧+日糧中添加50 mg/kg 福美雙+飲水中添加1 000 mg/L MOP，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)20 只雞，試驗(yàn)周期為15 d。在試驗(yàn)第4～7 天，福美雙組和3 個MOP 組飼料中添加福美雙；3 個MOP 組試驗(yàn)全程 （第0～15 天）在飲水中添加MOP。

1.4 肉雞飼養(yǎng)管理

采用單籠立式飼養(yǎng)，雞籠規(guī)格為60 cm×50 cm×50 cm；試驗(yàn)第1～2 天溫度保持在32～35 ℃，之后每周下降2～3 ℃；試驗(yàn)第1～3 天，每天光照24 h，便于雛雞采食和飲水，之后每天光照14 h；保持適宜濕度和通風(fēng)，自由采食和飲水。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 肉雞臨床表現(xiàn)及股骨形態(tài)學(xué)的觀察 觀察各組肉雞臨床表現(xiàn)并拍照記錄。 在試驗(yàn)第7、11、15 天進(jìn)行樣品采集， 每組分別選取10 只體重接近平均值的肉雞進(jìn)行屠宰取樣， 所有試驗(yàn)用肉雞采取頸椎錯位的方式處死， 然后立即取下肉雞大腿，對股骨的縱向肌群進(jìn)行剝離，暴露出沒有肌肉和脂肪附著的股骨，拍照對比。

1.5.2 股骨剪切力的測定 使用剪切力儀測定股骨剪切力，每個樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.5.3 股骨物理指標(biāo)的測定 暴露股骨后使用游標(biāo)卡尺測量股骨長度， 使用電子天平稱取股骨重量，利用阿基米德原理測定股骨密度和股骨體積。

1.5.4 股骨干物質(zhì)、 鈣磷含量和灰分的測定 分別于試驗(yàn)第7、11、15 天進(jìn)行股骨樣品采集。 用生理鹽水沖洗干凈股骨骨髓腔，用剪刀、鑷子把股骨剪碎放于研缽中，置105 ℃烘干箱烘干至恒重，記錄股骨干重，并計算干物質(zhì)含量［干物質(zhì)（%）=干重/鮮重×100%］。 之后，將股骨研磨成粉末狀在電爐上碳化至無煙，再將其放于馬弗爐（SX2）灰化［8］，用乙二胺四乙酸銨鈉（EDTA）絡(luò)合滴定法和釩鉬黃比色法測定股骨鈣（Ca）和磷（P）的含量［9］。通過以下公式計算灰分及灰分密度［10］： 灰分（DM）（%）=灰分重/干物質(zhì)×100%；灰分（FM）（%）=灰分重/濕基×100%；灰分密度（asd）=灰分重/體積。

1.5.5 血漿鈣離子和無機(jī)磷含量的測定 于試驗(yàn)第7、11、15 天進(jìn)行樣品采集，抗凝管靜脈取血，3 500 r/min 離心15 min， 將血漿分裝于1.5 mL 離心管并于-20 ℃冰箱中保存。 分別以微板法、磷鉬酸法測定血漿中鈣離子含量和無機(jī)磷含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）時，用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞股骨臨床解剖情況

對照組肉雞形態(tài)正常，能夠正常行走站立，骨骼發(fā)育正常無畸變（見圖1a、圖1b）；發(fā)病組肉雞常臥于籠內(nèi)，不能正常行走，跛行，嚴(yán)重者無法站立，骨骼發(fā)育異常（見圖1c、圖1d）。 將試驗(yàn)第7 天不同處理組的股骨進(jìn)行臨床解剖， 拍照對比結(jié)果見圖1e。 由圖1e 可知，對照組肉雞的股骨長于其他組，說明福美雙處理后肉雞的股骨變形，股骨生長受到抑制。

圖1 試驗(yàn)第7 天不同處理組肉雞臨床表現(xiàn)及股骨解剖圖

2.2 福美雙及MOP 對肉雞股骨剪切力的影響

在解剖過程中發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過福美雙處理的肉雞股骨與正常肉雞相比更容易斷裂，因此，認(rèn)為股骨可能受到了福美雙毒性的損傷，導(dǎo)致強(qiáng)度減弱。通過測定試驗(yàn)第7 天各組肉雞的股骨剪切力發(fā)現(xiàn)，福美雙組肉雞的股骨剪切力與對照組相比顯著（P<0.05）降低；與福美雙組相比，不同劑量MOP組的股骨剪切力差異不顯著（P>0.05）（見圖2）。

圖2 各組肉雞股骨剪切力的測定及比較結(jié)果

2.3 福美雙及MOP 對肉雞股骨物理指標(biāo)的影響

為了解福美雙對肉雞股骨指數(shù)的影響以及MOP 對福美雙誘導(dǎo)的股骨發(fā)育不良的保護(hù)效果，該試驗(yàn)測定并比較了各組肉雞的股骨重量、長度、體積、密度，結(jié)果見圖3。 由圖3 可知，在整個試驗(yàn)階段，福美雙組的股骨重量顯著（P<0.05）低于對照組； 除試驗(yàn)第11 天低劑量MOP 組的股骨重量顯著（P<0.05）高于福美雙組外，福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨重量差異均不顯著（P>0.05）。

圖3 各組肉雞股骨物理指標(biāo)的測定及比較結(jié)果

測量股骨長度發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗(yàn)第7天福美雙組和低劑量MOP 組的股骨長度顯著（P<0.05）降低，中劑量MOP 組和高劑量MOP 組的股骨長度變化不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第11 天福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨長度都顯著 （P<0.05） 降低； 試驗(yàn)第15 天福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨長度顯著（P<0.05）降低，而低劑量MOP 組和中劑量MOP 組的股骨長度顯著 （P<0.05）大于福美雙組。

股骨體積測定結(jié)果顯示， 試驗(yàn)第7 天福美雙組的股骨體積顯著（P<0.05）低于對照組，而不同劑量MOP 組與福美雙組的股骨體積差異均不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第11 天福美雙組的股骨體積顯著（P<0.05）低于對照組和低劑量MOP 組，而中劑量MOP 組和高劑量MOP 組的股骨體積與福美雙組相比差異不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第15 天各組股骨體積均無顯著（P>0.05）差異。

股骨密度測定結(jié)果顯示， 試驗(yàn)第7 天福美雙組的股骨密度顯著（P<0.05）低于對照組，此外，福美雙組的股骨密度與不同劑量MOP 組相比差異均不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第11 天和第15 天各組股骨密度均無顯著（P>0.05）差異。

2.4 福美雙及MOP 對肉雞股骨干物質(zhì)含量、灰分及鈣磷含量的影響

由表1 可知，股骨干物質(zhì)含量檢測結(jié)果顯示：試驗(yàn)第7 天福美雙組的股骨干物質(zhì)含量與對照組相比無顯著（P>0.05）差異，而中劑量MOP 組的股骨干物質(zhì)含量與福美雙組和對照組相比顯著（P<0.05）減少；試驗(yàn)第11 天福美雙組的股骨干物質(zhì)含量顯著（P<0.05）低于對照組，高劑量MOP 組與福美雙組相比股骨干物質(zhì)含量顯著 （P<0.05）增加；試驗(yàn)第15 天各組股骨干物質(zhì)無顯著（P>0.05）差異。

表1 各組肉雞股骨干物質(zhì)含量、灰分與鈣磷含量的測定及比較結(jié)果

股骨灰分檢測結(jié)果顯示： 試驗(yàn)第7 天各組的股骨灰分（FM）無顯著（P>0.05）差異，福美雙組的股骨灰分（DM）與對照組相比變化不顯著（P>0.05），低劑量MOP 組與中劑量MOP 組的股骨灰分（DM）顯著（P<0.05）低于對照組，但與福美雙組相比差異不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第11 天福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨灰分（FM）顯著（P<0.05）低于對照組，福美雙組的股骨灰分（DM）與對照組相比變化不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)第15 天福美雙組的股骨灰分（FM）與灰分（DM）與對照組相比無顯著（P>0.05）變化，高劑量MOP 組的股骨灰分（FM）和低劑量MOP 組的股骨灰分（DM）顯著（P<0.05）低于對照組。

股骨灰分密度測定結(jié)果顯示： 試驗(yàn)第7 天福美雙組的股骨灰分密度與對照組相比無顯著（P>0.05）變化，中劑量MOP 組的股骨灰分密度顯著（P<0.05）低于對照組；試驗(yàn)第11 天福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨灰分密度與對照組相比均顯著（P<0.05）減少；試驗(yàn)第15 天各組股骨灰分密度無顯著（P>0.05）差異。

股骨鈣磷含量測定結(jié)果顯示： 試驗(yàn)第7 天福美雙組和高劑量MOP 組的股骨鈣含量顯著 （P<0.05）低于對照組，低劑量MOP 組和中劑量MOP組的股骨鈣含量與對照組和福美雙組相比差異不顯著（P>0.05），各組磷含量均無顯著（P>0.05）差異；試驗(yàn)第11 天福美雙組的股骨鈣磷含量與對照組相比無顯著（P>0.05）差異，中劑量MOP 組和高劑量MOP 組的股骨磷含量顯著（P<0.05）低于對照組和福美雙組；試驗(yàn)第15 天福美雙組和不同劑量MOP 組的股骨鈣磷含量與對照組相比均無顯著（P>0.05）差異。

2.5 福美雙及MOP 對肉雞血漿鈣離子和無機(jī)磷含量的影響

由圖4Ⅰ可知，在整個試驗(yàn)期間，各組肉雞的血漿鈣離子含量無顯著（P>0.05）差異，但試驗(yàn)第7天低劑量MOP 組和中劑量MOP 組的血漿鈣離子含量與對照組和福美雙組相比有所提高， 并且第11 天不同劑量MOP 組的血漿鈣離子含量與對照組相比均有不同程度的提高。

由圖4Ⅱ可知，試驗(yàn)第7 天和第11 天各組肉雞的血漿無機(jī)磷含量無顯著（P>0.05）差異，但試驗(yàn)第7 天福美雙組的血漿無機(jī)磷含量低于對照組，同時，不同劑量MOP 組的血漿無機(jī)磷含量顯示出高于對照組的趨勢； 試驗(yàn)第15 天中劑量MOP 組的血漿無機(jī)磷含量與對照組相比顯著（P<0.05）升高。

圖4 各組肉雞血漿鈣離子和無機(jī)磷含量的測定及分析結(jié)果

3 討論

福美雙是一種廣譜殺菌劑，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。 研究表明，福美雙能誘發(fā)家禽腿?。?1］。該研究結(jié)果表明，在日糧中添加福美雙后，肉雞出現(xiàn)明顯的運(yùn)動減少、 跛行甚至不能直立行走的現(xiàn)象，說明福美雙可誘發(fā)肉雞腿病，這與Rath 等［12］的研究結(jié)果一致。

骨骼在脊椎動物中起到運(yùn)動、 支持和保護(hù)機(jī)體的功能， 也是制造紅細(xì)胞和白細(xì)胞以及儲藏礦物質(zhì)的部位［13］。 之前關(guān)于福美雙的研究主要集中在其誘導(dǎo)肉雞發(fā)生脛骨軟骨發(fā)育不良， 進(jìn)而研究其發(fā)病機(jī)制［14］。 該研究在福美雙對肉雞的暴露過程中發(fā)現(xiàn)，健康肉雞經(jīng)過福美雙處理，股骨的生長發(fā)育受到不同程度的影響。

在該試驗(yàn)收集肉雞股骨樣本的過程中， 發(fā)現(xiàn)經(jīng)過福美雙處理后股骨剝離時更容易斷裂， 進(jìn)一步測定股骨的剪切力顯示， 福美雙組股骨剪切力顯著（P<0.05）低于對照組，說明福美雙毒性會造成股骨強(qiáng)度降低， 進(jìn)而導(dǎo)致骨骼畸變和骨折風(fēng)險增大。 MOP 能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，對骨骼發(fā)育具有保護(hù)作用［15］。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，在給予不同劑量MOP 后， 肉雞的股骨剪切力有不同的變化，高劑量MOP 組的股骨剪切力與對照組接近，說明高劑量的MOP 對福美雙誘導(dǎo)的股骨損傷具有一定的積極作用，能夠減輕股骨損傷，從而起到一定的治療效果。

此外， 臨床解剖結(jié)果顯示對照組股骨發(fā)育優(yōu)于福美雙組。 為了進(jìn)一步研究福美雙毒性對股骨的影響，該試驗(yàn)測定了股骨的物理指標(biāo)，如股骨長度、重量、密度等，用來比較各組肉雞的股骨發(fā)育情況。 家禽育成期內(nèi)腿骨重量和長度的絕對生長值與其體高和體重存在密切關(guān)系，其中，長骨的發(fā)育程度對雞只的體高又起著決定性作用。 在生長階段各組織與器官的良好發(fā)育， 以及產(chǎn)生合理的軀體結(jié)構(gòu)對生產(chǎn)性能潛力的發(fā)揮都會產(chǎn)生直接影響［16］。 該研究結(jié)果表明，日糧中添加福美雙后，肉雞的股骨長度、重量、體積都明顯低于健康肉雞，說明福美雙能降低股骨的長度、 抑制股骨重量的增長，從而進(jìn)一步抑制肉雞身高體重的增長，這會導(dǎo)致肉雞體型小、生長發(fā)育慢。骨密度全稱是骨骼礦物質(zhì)密度，是衡量骨骼強(qiáng)度的一個重要指標(biāo)［17］，骨密度過低會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險增加。 該研究結(jié)果表明，日糧中添加福美雙后，肉雞的股骨密度明顯降低，而在低劑量MOP 的作用下，股骨密度有一定程度的回升。結(jié)合股骨剪切力結(jié)果提示，福美雙對肉雞股骨強(qiáng)度造成明顯損傷， 使股骨脆性增加，強(qiáng)度降低，容易斷裂，從而引起腿病。 而MOP 對福美雙毒性具有一定的拮抗作用， 能夠改善股骨密度，有利于股骨生長發(fā)育，減少腿病發(fā)生。

骨骼中灰分以及鈣和磷含量等是衡量骨骼質(zhì)量的重要評價指標(biāo)［18-19］。 灰分是指某種物質(zhì)在高溫時，發(fā)生一系列物理和化學(xué)變化，最后有機(jī)成分揮發(fā)、逸散，殘留下來的無機(jī)物?；曳趾吭礁?，骨骼中所含的無機(jī)礦物質(zhì)含量越高，骨骼密度越高，骨骼抗壓能力越強(qiáng)［20］。該研究結(jié)果顯示，在試驗(yàn)第11 天福美雙組的股骨干物質(zhì)含量及灰分（FM）顯著（P<0.05）低于對照組；而在其他發(fā)育時間段，福美雙組的股骨干物質(zhì)含量及灰分（FM）和灰分（DM）呈不顯著（P>0.05）變化，但有降低的趨勢，而不同劑量MOP 組有一定的升高。 由此可知，福美雙會引起肉雞股骨干物質(zhì)含量和灰分降低。 骨骼的抗壓程度和堅硬度依賴礦物基質(zhì)的主要成分羥基磷灰石，而鈣鹽構(gòu)成了骨架的主要無機(jī)部分，是羥基磷灰石晶體的主要組成部分［21］。 骨礦化是指鈣磷等無機(jī)鹽在骨組織中的沉積過程。該研究結(jié)果表明，福美雙暴露組肉雞的股骨鈣含量顯著（P<0.05）低于健康肉雞，磷含量變化不顯著（P>0.05）；肉雞攝入MOP 后，股骨鈣的含量有一定程度的增加。 這說明福美雙毒性會減少股骨鈣沉積， 從而影響股骨發(fā)育，而MOP 能夠促進(jìn)骨鈣沉積，從而改善福美雙造成的股骨損傷；另外，研究發(fā)現(xiàn)骨鈣與骨磷相比對福美雙暴露更為敏感， 故推測福美雙發(fā)揮其毒性作用主要與骨鈣代謝有關(guān)。

除了骨骼鈣磷含量， 血漿中的鈣磷離子含量也能反映機(jī)體的鈣磷代謝功能［22］。 血漿鈣磷離子含量與動物的骨骼代謝密切相關(guān)， 血液中的鈣能轉(zhuǎn)移到骨骼中形成鈣鹽， 為新骨的形成提供必要條件［23］。正常情況下，機(jī)體內(nèi)血漿鈣磷離子含量是穩(wěn)定的，但在機(jī)體鈣磷離子代謝發(fā)生明顯異常時，血漿鈣磷離子含量會升高或降低［24］。 該研究結(jié)果表明， 福美雙在肉雞發(fā)育早期會使血漿鈣磷離子含量減少，而添加MOP 后血漿鈣磷水平表現(xiàn)出升高趨勢， 說明福美雙暴露可能會在肉雞發(fā)育早期影響血漿鈣磷水平。因此，推測福美雙可能通過擾亂鈣磷代謝平衡影響股骨發(fā)育，而MOP 能夠?qū)υ摲N代謝紊亂起到一定程度的改善作用。

4 結(jié)論

福美雙通過抑制肉雞股骨生長發(fā)育， 降低股骨強(qiáng)度和鈣磷沉積， 進(jìn)而對股骨生長發(fā)育產(chǎn)生毒性作用，致使股骨出現(xiàn)損傷，而MOP 在一定程度上有保護(hù)和緩解效果。