高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中異煙肼、利福平及其在健康男性體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究*

張美微，陸優(yōu)麗，忻亮，李水軍，劉罡一，董春霞，張夢琪，梁立宇，繆怡，賈晶瑩（上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院＆中國科學(xué)院上海臨床研究中心.中心實(shí)驗(yàn)室，.輸血科，上海 200031）

異煙肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampicin，RFP）是目前預(yù)防和治療結(jié)核?。╰uberculosis，TB）的一線藥物，臨床上常將二者聯(lián)合應(yīng)用以提高療效，延緩結(jié)核桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的抗藥性。

INH在體內(nèi)經(jīng)N－乙酰基轉(zhuǎn)移酶2（N-acetyltransferase，NAT2）和酰胺水解酶（amide hydrolase，AH）催化直接或間接生成乙酰異煙肼和肼，兩者均具有肝毒性［1］。慢性肝病或嚴(yán)重腎功能不全的患者使用INH后可發(fā)生嚴(yán)重甚至是致死性的藥物性肝炎。RFP 可誘導(dǎo)肝藥酶活性，加速乙酰異煙肼代謝為乙酰肼，INH與RFP 聯(lián)合應(yīng)用時肝毒性明顯增強(qiáng)［2］，已有治療后發(fā)生卟啉癥惡化的個案報道。有證據(jù)表明，NAT2的基因型決定RFP 的代謝基本分為快代謝［（半衰期t1／2）為1～2 h］和慢代謝（t1／2為2～5 h）兩種，其中RFP 慢代謝型的危險性是快代謝型的28 倍［3-6］，并且基因型與表型結(jié)果基本一致。因此準(zhǔn)確測定血藥濃度并結(jié)合代謝類型，合理地制定個性化用藥方案尤為重要。

本研究旨在建立簡便、可靠的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS／MS）分析方法，檢測人血漿中INH和RFP 的濃度，研究中國健康男性體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)特征，為臨床進(jìn)行治療藥物監(jiān)測提供可靠的檢測手段和臨床數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 API4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；液相系統(tǒng)（日本島津公司）包括SIL-HTc 自動進(jìn)樣器，LC-20AD 輸液泵，DGU-20A3在線脫氣儀，CBM-20A控制器；EHMA切換閥（美國Valco Instrument 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

RFP、INH 標(biāo)準(zhǔn)品（歐洲藥典）；利福平－氘3（RFP-d3）、異煙肼－氘4（INH-d4）購自加拿大TRC公司；甲酸、甲醇、甲酸胺（HPLC 級）購自德國CNW公司；乙腈（HPLC 級）購自美國DIKMA 公司；抗壞血酸（VC）（分析純）購自中國國藥集團(tuán)；水為Millipore Advantage A10 制超純水；空白人肝素鈉抗凝血漿來源于健康志愿者。

1.2 RFP 和INH的色譜條件 見表1。

表1 RFP 和INH的色譜條件

1.3 INH和RFP 的質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子模式（ESI＋）下多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜源參數(shù)：霧化氣（GAS1）為60 psi（1 psi＝6.895 kPa），輔助加熱氣（GAS2）為60 psi，氣簾氣（CUR）為30 psi，離子源加熱溫度（TEM）分別為550 ℃（INH）和500 ℃（RFP）；離子噴霧電壓（IS）分別為1 500 V（INH）和5 500 V（RFP）；分析參數(shù)見表2。

表2 INH和RFP 的分析參數(shù)

1.4 溶液的制備 精密稱取適量RFP 和INH，用甲醇制備成446 μg／mL（INH）、864 μg／mL（RFP）的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取INH／RFP 儲備液，加入適當(dāng)體積含9.5 mmol／L VC的50%乙腈水溶液（稀釋液），制成含INH／RFP 濃度為0.05／0.1、0.1／0.2、1／2、5／10、20／40、45／90、50／100 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)添加液，0.05／0.1（定量下限）、0.15／0.3（低）、10／20（中）、40／80（高）、200／400（稀釋）μg／mL的質(zhì)控添加液，添加液臨用時新鮮配制。精密稱取適量INH-d4和RFP-d3，用甲醇制備成98 μg／mL（INH-d4和RFP-d3）的內(nèi)標(biāo)儲備液，所有儲備液置于－90～－70 ℃保存。臨用時取稀釋液稀釋至所需濃度作為工作液備用。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 樣品制備均在冰上操作且避免太陽光照射。取血漿100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液和300 μL甲醇，混旋10 s，7 715×g（4 ℃）離心3 min。吸取上清液25 μL，加入100 μL 30%乙腈水溶液，混勻后用于RFP 的進(jìn)樣分析；另取上清液25 μL，加入100 μL 80%乙腈水溶液，混勻后用于INH的進(jìn)樣分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理 用Analyst Software（1.6.1）軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及定量計算，用SAS軟件對血藥濃度－時間數(shù)據(jù)以非房室模型方法對其藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計計算及分析。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 方法學(xué)評價

2.1.1 選擇性 分別取人空白血漿、加入標(biāo)準(zhǔn)添加液和內(nèi)標(biāo)工作液的血漿樣品和服用試驗(yàn)藥物研究對象的血漿樣品，按“1.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，得到色譜圖，見圖1、2，各樣品分離度良好，內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾。

圖1 INH及INH-d4 典型色譜

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白血漿90 μL，加入10 μL INH／RFP 標(biāo)準(zhǔn)添加液，漩渦混勻，配制成含INH／RFP濃度為5／10、10／20、100／200、500／1000、2 000／4 000、4 500／9 000、5 000／10 000 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“1.5”項(xiàng)下操作，以理論濃度為X軸，分析物和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，按權(quán)重因子1／X，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。INH在5～5 000 ng／mL范圍內(nèi)，RFP 在10～10 000 ng／mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.99。

2.1.3 精密度 取空白血漿90 μL，加入10 μL INH／RFP 質(zhì)控添加液，漩渦混勻，制得5、15、1 000、4 000、20 000 ng／mL質(zhì)控樣品，每個濃度平行配制6份，按“1.5”項(xiàng)下操作，連續(xù)3 個批次，考察精密度，見表3。

圖2 RFP 及RFP-d3 典型色譜

表3 HPLC-MS／MS法測定INH及RFP 濃度的精密度

2.1.4 提取回收率 制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品，按“1.5”項(xiàng)下操作，得峰面積EPA；另取空白血漿，經(jīng)過同樣的預(yù)處理后，加入對應(yīng)濃度的質(zhì)控添加液和內(nèi)標(biāo)工作液進(jìn)行分析，得峰面積UPA。以上樣品重復(fù)測定6 次，計算提取回收率，公式為R（%）＝EPA／UPA平均值×100%，結(jié)果見表4。

表4 HPLC-MS／MS法測定INH和RFP 的提取回收率

2.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 取6個不同來源的空白血漿各6份，不加內(nèi)標(biāo)，按“1.5”項(xiàng)下操作，吸取上清液，加入低、高濃度質(zhì)控添加液和內(nèi)標(biāo)工作液，進(jìn)樣分析得峰面積A；對應(yīng)濃度化學(xué)品溶液進(jìn)樣分析得峰面積AC；以A／AC平均值的比值計算基質(zhì)因子（MF），以MF（分析物）／MF（內(nèi)標(biāo)）的比值計算內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子。結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后，INH 在0.899～1.294范圍內(nèi)，RFP 在0.970～1.049范圍內(nèi)，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.6 穩(wěn)定性 制備（INH 為15 ng／mL，RFP 為30 ng／mL）、高（INH為4 000 ng／mL，RFP 為8 000 ng／mL）濃度的血漿質(zhì)控樣品，考察短期（室溫／2～8 ℃）放置、多次凍融及長期凍存（－90～－70 ℃）的穩(wěn)定 性。制 備 低（INH 為15 ng／mL，RFP 為30 ng／mL）、高（INH為4 000 ng／mL，RFP 為8 000 ng／mL）濃度的全血質(zhì)控樣品，考察室溫放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，INH和RFP 的血漿樣品室溫（15～25 ℃）放置2 h、冷藏（2～8 ℃）放置24 h，反復(fù)凍融3次，冷凍（－90～－70 ℃）保存28 d均穩(wěn)定；全血樣品室溫放置1 h較穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5 INH和RFP 在血漿及全血中的穩(wěn)定性

將同一來源的儲備液和工作液分裝，考察分析物儲備液室溫及長期凍存（－90～－70 ℃）和工作液室溫放置的穩(wěn)定性；內(nèi)標(biāo)工作液2～8 ℃和室溫放置的穩(wěn)定性。INH和RFP 儲備液和工作液室溫至少可存放4 h，儲備液－90～－70 ℃下至少可保存31 d，內(nèi)標(biāo)工作液室溫至少可存放4 h，2～8 ℃至少可保存24 h，結(jié)果均較穩(wěn)定。

2.2 臨床研究 選擇年齡為18～55 周歲（含18、55周歲）的24 例中國健康男性（符合方案的入選標(biāo)準(zhǔn)）作為研究對象，進(jìn)行單次口服Rifinah?（INH片150 mg／RFP300 mg）藥動學(xué)研究。本研究經(jīng)上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（文號：2014-28），所有研究對象均簽署知情同意書。研究對象給藥開始前10 h內(nèi)以及服藥后4 h內(nèi)禁止飲食，分別于給藥前（0 h）和給藥后第15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、24 h采集3 mL靜脈血，肝素鈉抗凝，并在2～8 ℃下，于采樣完成30 min內(nèi)離心（1 500×g離心5 min）獲得血漿，血漿樣品保存于－90～－70 ℃冰箱中待測。

各時間點(diǎn)INH和RFP 平均濃度與時間的曲線見圖3，主要的藥代動力學(xué)參數(shù)見表6，本研究中RIF的各項(xiàng)藥代動力學(xué)參數(shù)個體間變異較小，而INH藥代動力學(xué)特征存在明顯個體差異，24例健康志愿者中11 例T1／2≥2 h 為慢乙?；?5.8%），13例T1／2＜2 h為快乙?；?4.2%），峰濃度（Cmax）、個體間變異均較大（CV＞30%）。本研究中NAT2酶快慢代謝能力、比率及INH半衰期與文獻(xiàn)報道基本一致，與說明書中描述的大多數(shù)亞洲人屬INH快代謝型相符。

表6 研究對象單次口服150 mg INH和300 mg RFP 后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

圖3 研究對象口服150 mg INH 和300 mg RFP 后INH和RFP 的平均劑量－時間曲線（n＝24）

3 討論

研究表明，RFP 易被氧化且對光略敏感，需加抗氧化劑增加穩(wěn)定性，另外INH 和RFP 的混合物對熱不穩(wěn)定，因此方法條件的探索時考察了抗壞血酸VC（含量分別為0、2.5、5.0、9.5 mmol／L）、光照（日光燈下2、6、24 h）、溫度（冷藏／2～8 ℃，室溫／15～25 ℃）對血漿樣本中分析物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示，在血漿中加入VC 9.5 mmol／L 可顯著增加分析物的穩(wěn)定性；光照對RFP 的影響不顯著，因此可在日光燈下進(jìn)行樣品的采集和處理；分析物在2～8 ℃下保存穩(wěn)定性時間延長，因此血漿樣品前處理在冰上操作。

從化合物結(jié)構(gòu)判斷（見圖4），INH 屬于極性較大的化合物，在親水色譜柱上保留較好，因此選用Atlantis HILIC 作為分析柱，克服了INH 保留時間短的問題且提高了靈敏度。而RFP 極性中等偏弱，在反相色譜柱上有較好的色譜行為，所以選用Syncronis C18作為分析柱。

圖4 化合物RFP、RFP-d3、INH及INH-d4 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本研究通過向血漿樣品中加入抗氧化劑來增加穩(wěn)定性且樣本預(yù)處理方法簡便（蛋白質(zhì)沉淀法），INH和RFP 的最低定量檢測限分別為5 ng／mL 和10 ng／mL（已報道的國內(nèi)外文獻(xiàn)尚無低于本值者）。目前，國內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報道單獨(dú)或者同時檢測INH 和 RFP 血藥濃度的高效液相色譜法（HPLC-UV），但是這些方法有很多局限性，如樣品預(yù)處理采用固相萃取（SPE）及衍生化方法樣品制備步驟繁瑣，樣品使用體積較大，檢測靈敏度低，分析時間長等問題［7-9］；大多數(shù)HPLC 分析方法使用C18色譜柱檢測INH，使其色譜保留有限，容易受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

本研究中入組的男性體內(nèi)INH 的藥動學(xué)特征符合文獻(xiàn)報道［10］的大多數(shù)亞洲人的代謝特征，INH代謝個體間差異顯著主要與NAT2基因型有關(guān)，如若不能根據(jù)患者代謝類型制定個體化給藥方案，直接影響到藥物的療效。臨床應(yīng)用時可通過監(jiān)測患者血藥濃度結(jié)合NAT2 代謝表型來判斷給藥劑量是否合理，后續(xù)可收集數(shù)據(jù)開發(fā)能指導(dǎo)臨床給藥的PK-PD模型，這對于患者（尤其是老年人，兒童等特殊群體患者）降低不良反應(yīng)的發(fā)生率和程度，保證給藥劑量，提高療效、減少耐藥性，以及減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重大意義。