肝X受體激動(dòng)劑TO901317對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用△

丁劍鋒 楊煒 李璐 司超

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病主要慢性并發(fā)癥之一，其與視網(wǎng)膜炎癥、氧化應(yīng)激及微血管病變密切相關(guān)。DR可引起視網(wǎng)膜炎癥和微血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病患者視力減退甚至致盲[1-4]。目前針對(duì)DR的主要治療方式為玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物，但其價(jià)格昂貴，導(dǎo)致患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重。因此開發(fā)療效更好、性價(jià)比更高的藥物對(duì)于預(yù)防和治療DR十分必要。

肝X受體為一種核受體，其激動(dòng)劑TO901317可以通過啟動(dòng)ABCA1轉(zhuǎn)錄，抑制核因子κB活性，從而下調(diào)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、iNOS、COX2等炎癥因子表達(dá)，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，進(jìn)而在腦、肺和視網(wǎng)膜等組織器官發(fā)生缺血缺氧損傷時(shí)發(fā)揮一定的抗炎作用[5-9]。研究證明，IL-1β、IL-6和VEGF是DR患者視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)鍵影響因素[10-12]，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)BCA1能抑制 IL-1β 的表達(dá)，在缺血缺氧刺激因素作用下對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用[13]。但肝X受體激動(dòng)劑TO901317與DR的發(fā)生發(fā)展是否有密切關(guān)系目前鮮有報(bào)道。本研究通過分析TO901317對(duì)DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)、新生血管形成及視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6和VEGF表達(dá)的影響，探討TO901317對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取24只健康SPF級(jí)SD大鼠(購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘，體重180～220 g，鼠齡8～12周，隨機(jī)分為正常組、模型組、TO901317組，每組各8只。動(dòng)物飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，飼養(yǎng)濕度45%～55%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在安靜環(huán)境下自由進(jìn)食和飲水。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照《石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)條例》進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器RNeasy Mini Kit 試劑盒(德國(guó) Qiagen 公司)，β-actin一抗、二抗(北京中杉金橋公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6一抗和TO901317(美國(guó) Sigma公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6引物(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(美國(guó) Promega公司)，IL-1β 、IL-6 ELISA試劑盒(美國(guó)ADL公司)，CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 各組大鼠處理正常組大鼠不做任何處理；模型組、TO901317組大鼠在禁食24 h后測(cè)量空腹血糖濃度，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素60 mg·kg-1，1周后采尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖濃度。此后每月檢測(cè)空腹血糖濃度1次，以空腹血糖濃度持續(xù)24周高于16.7 mmol·L-1作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)； TO901317組大鼠在造模后第25周時(shí)一次性雙眼玻璃體內(nèi)注射5 μL TO901317(3.125 g·L-1)，正常組、模型組大鼠此階段不做任何處理。

1.2.2 空腹血糖濃度檢測(cè)各組大鼠造模前和造模結(jié)束時(shí)，均于禁食24 h后采集尾靜脈血，以羅氏血糖儀檢測(cè)空腹血糖濃度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 視網(wǎng)膜標(biāo)本制備造模結(jié)束并檢測(cè)空腹血糖濃度后以10 g·L-1水合氯醛 0.6 g·kg-1腹腔內(nèi)注射過量麻醉處死各組大鼠，迅速摘取雙側(cè)眼球于動(dòng)物手術(shù)顯微鏡下在冰面上迅速鈍性分離視網(wǎng)膜，一側(cè)眼球的視網(wǎng)膜浸入4 g·L-1多聚甲醛固定液中固定24 h，按照常規(guī)步驟脫水、透明、浸蠟和包埋，用于HE染色；另一側(cè)眼球放置于液氮中保存，用于ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 HE染色制作平行于視神經(jīng)的連續(xù)矢狀眼球切片，片厚4 μm，攤片、烤片后用二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，蘇木精初染2 min，用體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸乙醇分化5 s，1 g·L-1氨水返藍(lán)5 s，0.5 g·L-1伊紅液復(fù)染4 min，脫水、透明后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和微血管變化情況，測(cè)量各組大鼠視網(wǎng)膜厚度。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量取出部分液氮內(nèi)凍存的視網(wǎng)膜組織，嚴(yán)格按照IL-1β、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒操作步驟檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)IL-1β、IL-6含量。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量取適量大鼠視網(wǎng)膜組織冰上剪碎研磨后，利用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取各組大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA，檢測(cè)合格后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，按相應(yīng)試劑盒說明書步驟擴(kuò)增ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA，選取β-actin為內(nèi)參，具體引物序列見表1。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按照95 ℃ 30 s(預(yù)變性)，95 ℃ 10 s(變性)，60 ℃ 20 s(退火)，75 ℃ 20 s(延伸)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，用生理鹽水清洗后于EP管內(nèi)在冰上將組織剪碎，加入蛋白裂解液進(jìn)行組織裂解，提取蛋白后用BCA法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h，分別加入稀釋的目的蛋白ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF和內(nèi)參β-actin一抗(11000)，置于4 ℃搖床上孵育過夜后加入相應(yīng)二抗(15000)，用TBST洗膜3次，每次10 min，隨后置于暗室內(nèi)發(fā)光、壓片、曝光、顯影、定影，采集圖像，用ImageJ 1.8.0分析各組蛋白條帶灰度值，利用內(nèi)參進(jìn)行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠造模前后空腹血糖濃度造模前各組大鼠空腹血糖濃度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；造模后模型組和TO901317組大鼠空腹血糖濃度均較各自造模前和正常組造模后明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠造模前后空腹血糖濃度

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及厚度變化正常組大鼠視網(wǎng)膜各層組織間連接緊密，細(xì)胞排列整齊，各細(xì)胞形態(tài)及微血管結(jié)構(gòu)正常。模型組和TO901317組大鼠視網(wǎng)膜可見內(nèi)界膜腫脹斷裂嚴(yán)重，部分內(nèi)皮細(xì)胞突出內(nèi)界膜，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞減少明顯，微血管結(jié)構(gòu)遭到破壞，內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層細(xì)胞數(shù)量也減少，排列稀疏；兩組大鼠視網(wǎng)膜厚度均較正常組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；TO901317組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)改變介于正常組與模型組之間，視網(wǎng)膜厚度較模型組明顯變薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1和表3)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片HE染色結(jié)果 GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度和視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6的含量

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量與正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β和IL-6含量均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；TO901317組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β和IL-6含量較模型組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表3)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常組和TO901317組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常組和TO901317組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常組和TO901317組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常組和TO901317組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖2和表5)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)情況

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

DR是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，主要損傷視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成患者視力損害甚至喪失，嚴(yán)重影響中老年糖尿病患者的健康和生活。DR主要與視網(wǎng)膜脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和微血管病變有關(guān)[14-16]。DR發(fā)生發(fā)展過程中視網(wǎng)膜長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，炎癥因子表達(dá)升高，以IL-1β和IL-6升高最為突出[17-18]。視網(wǎng)膜炎癥一方面造成視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞腫脹，排列疏松；另一方面長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)使視網(wǎng)膜血管壁結(jié)構(gòu)與通透性遭到破壞，產(chǎn)生微血管瘤，造成視網(wǎng)膜供血不足，組織缺血缺氧，進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)和視網(wǎng)膜損傷。受損的視網(wǎng)膜血管引發(fā)代償性新生血管形成，但視網(wǎng)膜新生血管無正常的血管功能及結(jié)構(gòu)，易發(fā)生破裂出血，出血部位易發(fā)生機(jī)化進(jìn)而造成視網(wǎng)膜裂孔和脫離，造成患者視力減退甚至喪失[19-20]。VEGF在促進(jìn)細(xì)胞增殖和新生血管形成中發(fā)揮重要作用[21-22]。研究證明，DR患者視網(wǎng)膜新生血管的嚴(yán)重程度與眼內(nèi)VEGF的水平密切相關(guān)，玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物(雷珠單抗、康柏西普)可以下調(diào)視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜新生血管形成[23]，抗VEGF已成為目前眼科臨床治療DR的一線方法。但因其價(jià)格昂貴，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大，尋找新的可以抑制DR患者視網(wǎng)膜炎癥且抗新生血管形成的藥物仍迫在眉睫。

肝X受體是一種核受體，在人類和小鼠視網(wǎng)膜上均有表達(dá)[24]。肝X受體通過激活并上調(diào)ABCA1的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)核因子κB的表達(dá)，在一定程度上可抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)激活的ABCA1在ATP作為能量供體的情況下，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇、游離磷脂的排出，從而發(fā)揮抗炎作用。當(dāng)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集形成泡沫細(xì)胞，入侵血管壁后也會(huì)促進(jìn)血管硬化[25]。已有研究證實(shí)，非特異性肝X受體激動(dòng)劑TO901317可以激活A(yù)BCA1，下調(diào)葡萄膜炎小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子的表達(dá)，從而起到抗炎和保護(hù)視神經(jīng)的作用[26]。

本研究通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠DR模型，注射后24周檢測(cè)大鼠空腹血糖濃度發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血糖濃度明顯升高，達(dá)到糖尿病造模水平。通過HE染色發(fā)現(xiàn),模型組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)腫脹、細(xì)胞排列疏松、視網(wǎng)膜厚度明顯增加、微血管結(jié)構(gòu)受損，證明DR大鼠模型制備成功。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量明顯升高， IL-1β、IL-6在mRNA和蛋白水平上表達(dá)均升高，說明DR大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥因子表達(dá)升高，炎癥反應(yīng)一定程度上導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織腫脹，細(xì)胞排列疏松。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)較正常組均明顯降低，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)較正常組均明顯升高，結(jié)合HE染色結(jié)果，說明炎癥反應(yīng)、ABCA1表達(dá)下降和VEGF表達(dá)升高可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管壁結(jié)構(gòu)異常，通透性增加，同時(shí)也促進(jìn)了新生血管形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在DR大鼠模型制備成功后給予3.125 g·L-1肝X受體激動(dòng)劑TO901317玻璃體內(nèi)注射后，大鼠視網(wǎng)膜各層組織腫脹、細(xì)胞排列疏松等視網(wǎng)膜損傷表現(xiàn)較模型組得到一定緩解，視網(wǎng)膜厚度也有所降低；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量較模型組下降，視網(wǎng)膜ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)較模型組均明顯升高，IL-1β、IL-6和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均較模型組明顯降低。這些結(jié)果說明，玻璃體內(nèi)注射TO901317可以上調(diào)ABCA1表達(dá)，在一定程度上抑制DR大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的高表達(dá)，緩解視網(wǎng)膜組織腫脹、厚度增加和細(xì)胞排列疏松等病理學(xué)改變，同時(shí)也可以抑制VEGF的高表達(dá)，在一定程度上降低DR大鼠視網(wǎng)膜血管損傷和新生血管形成。

綜上所述，肝X受體激動(dòng)劑TO901317可以上調(diào)ABCA1表達(dá)，下調(diào)IL-1β、IL-6和VEGF表達(dá)，抑制DR大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)和新生血管形成，對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜有一定保護(hù)作用。這為DR的預(yù)防和治療提供了新的藥物研究方向。