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    六氯苯脅迫對(duì)香蒲根系分泌次生代謝物組分的影響

    2021-08-30 01:56:52張翠萍魯廣秋劉淑娟李淑英周元清
    貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:香蒲水培苯甲酸

    張翠萍, 魯廣秋, 劉淑娟, 李淑英, 周元清

    (玉溪師范學(xué)院 污染控制與生態(tài)修復(fù)研究中心, 云南 玉溪 653100)

    0 引言

    【研究意義】根系分泌物是植物根系在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放到根際環(huán)境的各種有機(jī)化合物總稱。根系分泌物既是植物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交流的重要媒介,也是根際微生物可直接利用的重要碳源[1],與根際微生物對(duì)污染物的生物降解密切相關(guān)[2]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái),隨著根際生態(tài)學(xué)的建立和發(fā)展,對(duì)于根系分泌物的收集、檢測(cè)方法及分泌機(jī)制等方面的研究不斷深入。常用方法是將植物在實(shí)驗(yàn)室組培、水培或砂培[3-4],收集分泌物后采用高效液相色譜法(HPLC)、離子色譜法(IC)及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS,LC-MS)等[5]分離鑒定其種類和數(shù)量。根系分泌物的組成及含量變化是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫最直接和最明顯的反應(yīng)[6-7],研究聚焦于植物單因素環(huán)境脅迫[8]、營(yíng)養(yǎng)脅迫[9-10]、污染物脅迫[11-12]條件下植物根系分泌效應(yīng)及機(jī)理。持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs)是一類具有環(huán)境持久性、長(zhǎng)距離遷移能力、生物累積性和高生物毒性的特殊污染物。我國(guó)不同環(huán)境介質(zhì)及生物體中POPs污染不容樂(lè)觀,如何高效去除環(huán)境介質(zhì)中的POPs污染已成為研究者普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。濕地作為POPs在生物圈遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程中一個(gè)重要的“匯”,近年來(lái),濕地生態(tài)系統(tǒng)的POPs污染問(wèn)題備受關(guān)注。濕地植物的根際效應(yīng)是解決POPs污染的主要切入點(diǎn)[13-14],植物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[15],通過(guò)根系泌氧和根系分泌物,影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性[16-17],強(qiáng)化濕地根際效應(yīng)對(duì)污染物的生物降解與凈化能力[18-19]。植物根系分泌一定量的轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶和過(guò)氧化氫酶等外酶類物質(zhì)可直接降解有關(guān)的有機(jī)污染物。香蒲是全球廣布的多年生宿根性濕地草本植物之一,在水體氮磷吸收、重金屬累積、有機(jī)污染物去除等生態(tài)環(huán)保上的價(jià)值日益凸顯。據(jù)報(bào)道,香蒲生物降解持久性有機(jī)污染物六氯苯(Hexachlorobenzene,HCB)的能力較蘆葦強(qiáng)[20]?!狙芯壳腥朦c(diǎn)】根系分泌物介導(dǎo)的根際效應(yīng)在水體生態(tài)修復(fù)中有極大的應(yīng)用潛力[21],基于根系分泌物對(duì)POPs生物降解的影響開展了大量研究[7,22-23],但關(guān)于POPs脅迫對(duì)濕地植物根系分泌物組分變化特征影響的報(bào)道較少?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】深入探討香蒲根系分泌物對(duì)POPs降解的作用,以狹葉香蒲(Typhaangustifolia)植株為材料,以《斯德哥爾摩公約》中首批受控的HCB作為研究對(duì)象,水培法收集HCB脅迫下香蒲的根系分泌物,GC-MS技術(shù)檢測(cè)分泌物的組分種類和數(shù)量,分析HCB降解率與香蒲根系分泌物間的相關(guān)性,旨在為人工濕地去除水體氯苯類有機(jī)污染物的應(yīng)用及發(fā)展水生植物凈化污水提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 狹葉香蒲,云南省玉溪師范學(xué)院百草園種植,植株高20~40 cm,主根長(zhǎng)5~8 cm。

    1.1.2 試劑 有機(jī)污染物六氯苯(HCB)標(biāo)準(zhǔn)品(99.1%),AccuStandard Inc.;正己烷(分析純),廣州西隴化工;5% Hogland營(yíng)養(yǎng)液,自制;純水,采用Milli-Q制備;XAD-4大孔樹脂層析柱,Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;二氯甲烷(分析純),天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;無(wú)水硫酸鈉(分析純),廣州西隴化工;氫氧化鈉(分析純),廣州西隴化工;濃鹽酸(分析純),中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)。

    1.1.3 主要設(shè)備 Multi-3430 SET便攜式多參數(shù)分析儀,德國(guó)WTW公司;UPR-II超純水機(jī),西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司;CP214分析天平,美國(guó)奧豪斯公司;R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士布奇公司;KDB-12氮?dú)獯祾邇x,青島科迪博公司;SQ8T/ Clarus 680氣相色譜質(zhì)譜儀,美國(guó)PerkinElmer公司。

    1.2 方法

    1.2.1 材料預(yù)處理

    1) 處理液制備。采用HCB標(biāo)準(zhǔn)品溶于正己烷中配制1.0 mg/L HCB的污染儲(chǔ)備液。5% Hogland營(yíng)養(yǎng)液采用WANG等[23]的方法配制。配制質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的HCB標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2) 植物材料培養(yǎng)。將香蒲均一苗用自來(lái)水洗凈根部,再經(jīng)純水沖洗3次后放入裝有一定量純水的錐形瓶中預(yù)培養(yǎng)3 d備用。

    1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)營(yíng)養(yǎng)液空白對(duì)照(CK)、香蒲植株空白對(duì)照(CK1)和試驗(yàn)組(HCB)3個(gè)處理:添加1.0 mg/L HCB無(wú)香蒲的營(yíng)養(yǎng)液作為營(yíng)養(yǎng)液空白對(duì)照,用于測(cè)HCB的含量變化;未添加HCB有香蒲植株作為根系分泌物變化的香蒲植株空白對(duì)照;添加1.0 mg/LHCB有香蒲作為試驗(yàn)組。3個(gè)處理的每個(gè)培養(yǎng)時(shí)段設(shè)3次重復(fù),3株香蒲苗為1組,種植于200 mL 5% Hogland營(yíng)養(yǎng)液中,分別于水培1 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d取出植株。先用純水沖洗根系3次,沖洗液并入營(yíng)養(yǎng)液中便于HCB剩余量的測(cè)定。再將植株放入裝有200 mL超純水的錐形瓶?jī)?nèi),錐形瓶外用黑色紙包裹避光處理,在光照良好的條件下開始水培收集香蒲根系分泌物6 h(即13:30~19:30)。培養(yǎng)過(guò)程中注意補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液至初始量。

    1.2.3 香蒲根系分泌物的測(cè)定 采用便攜式Multi-3430 SET現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定根系分泌物收集液的pH、溶解氧DO(mg/L)、電導(dǎo)率EC(μs/cm)和氧化還原電位Eh(mV)4個(gè)指標(biāo)。將收集液通過(guò)活化好的XAD-4大孔樹脂層析柱,每個(gè)樣品過(guò)層析柱3次富集分泌物后,用洗耳球吹凈水溶液,每次用30 mL二氯甲烷分3次洗脫層析柱。為了減少水分,層析柱下面用裝有無(wú)水硫酸鈉的小燒杯盛洗脫液。最后洗脫液裝入分液漏斗,用二氯甲烷30 mL分2次萃取。萃取后取有機(jī)相,用烘干的無(wú)水硫酸鈉干燥處理后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。用約6 mL二氯甲烷分3次洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,洗滌液倒入10 mL的離心管中,將其進(jìn)行氮吹。氮吹至溶液少于1 mL時(shí)加入內(nèi)標(biāo)物正十七烷,然后用二氯甲烷定容到2 mL,振蕩混勻后裝入進(jìn)樣瓶待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。各試驗(yàn)組香蒲根系分泌物的圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合NIST 2011 Mass Spectral Library質(zhì)譜譜庫(kù)進(jìn)行匹配度分析,再采用面積歸一化法半定量計(jì)算香蒲根系分泌物的相對(duì)百分含量。

    1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

    1) 香蒲根系分泌物。參考KUMAR等[24-25]的方法,建立香蒲根系分泌物GC-MS測(cè)定條件。其中,GC分析條件:PE Elite-5MS毛細(xì)管柱(規(guī)格:30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純度氦氣(99.999%);進(jìn)樣口溫度:250℃;進(jìn)樣量:2.0 μL;載氣流量1 mL/ min;分流進(jìn)樣,分流比為40∶1;升溫程序:從50℃開始,先保持0 min,以50℃/min升至150℃,保持1 min;再以4℃/min升至250℃,維持1 min,最后以2℃/min升至270℃,維持3 min。MS分析條件:EI+源,離子源溫度 250℃;傳輸線溫度250℃;電子電壓70 eV;全掃描,TIC掃描,范圍為33~550 m/z。

    2) HCB濃度。測(cè)定香蒲培養(yǎng)液中的HCB濃度,樣品倒入分液漏斗中,再加入200 mL分析純正己烷,分3次進(jìn)行液-液萃取,萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,加約15 mL色譜純正己烷轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行氮吹濃縮,氮吹至溶液體積少于5 mL,再加入色譜純正己烷定容至5 mL,混勻后過(guò)0.45 μm濾膜裝瓶進(jìn)行GC-MS測(cè)定,測(cè)定條件同上。測(cè)定HCB標(biāo)準(zhǔn)溶液,外標(biāo)法定量,以HCB質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    采用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用SPSS 16.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn),采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行多重比較,檢驗(yàn)各指標(biāo)的差異顯著性(P<0.05)。Origin 8.0作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 根系分泌物收集液的pH、溶解氧、電導(dǎo)率和氧化還原電位

    根系分泌物的種類繁多,質(zhì)子和無(wú)機(jī)離子(如H+、NH4+、Na+、K+、Cl-、SO42-和HPO42-等)對(duì)根際pH及氧化還原電位(Eh)有一定的調(diào)節(jié)作用。從表1看出,水培不同時(shí)間后,香蒲根系分泌物收集液的pH和溶解氧(DO)總體呈先降后升再降趨勢(shì),而電導(dǎo)率(EC)和Eh則相反。

    2.1.1 pH HCB脅迫處理根系分泌物收集液的pH為5.53~6.06,隨培養(yǎng)時(shí)間增加呈先降后升再降趨勢(shì),處理1 d和15 d時(shí)的pH顯著高于其余時(shí)段,處理5 d時(shí)的pH顯著低于其余時(shí)段;對(duì)照(CK1)pH為5.47~6.20,呈先降后升趨勢(shì),處理30 d和1 d時(shí)的pH分別顯著高于和低于其余時(shí)段。HCB脅迫處理各時(shí)段pH較CK1的變化為-0.38~0.15,其中以處理30 d時(shí)HCB脅迫處理的pH較CK的變幅最大,二者間相差0.38;處理1 d和15 d時(shí)其次,二者均相差0.15;處理10 d時(shí)最小,二者間相差0.01。

    2.1.2 DO HCB脅迫處理與對(duì)照中,根系分泌物收集液的DO均隨培養(yǎng)時(shí)間增加呈先降后升再降趨勢(shì),處理15 d時(shí)的DO顯著高于其余時(shí)段,處理5 d時(shí)的DO顯著低于其余時(shí)段;HCB脅迫DO為3.26~6.64,而對(duì)照DO為3.58~6.54,表明HCB脅迫對(duì)香蒲根系分泌物收集液的DO影響不大。

    2.1.3 EC HCB脅迫下,根系分泌物收集液的EC隨培養(yǎng)時(shí)間增加而明顯升高,且試驗(yàn)組(HCB)與對(duì)照組(CK1)相比較,變化范圍為5.2~33.9 μs/cm,表明HCB脅迫下,香蒲根系分泌物收集液的導(dǎo)電性增強(qiáng)。HCB處理與CK1均在30 d時(shí)達(dá)峰值。

    2.1.4 Eh 培養(yǎng)1~5 d、20~25 d時(shí)間段,HCB脅迫誘導(dǎo)根系分泌物收集液的Eh升高,可能由于HCB脅迫促進(jìn)香蒲根系參與氧化還原反應(yīng)的氧化性物質(zhì)分泌。HCB脅迫下,濕地植物具有特殊的根系泌氧功能,環(huán)境脅迫下,香蒲水培收集液中Eh和DO水平升高,且受到植物類型、生長(zhǎng)發(fā)育期以及營(yíng)養(yǎng)狀況的影響。

    表1 HCB脅迫處理不同培養(yǎng)時(shí)間根系分泌物收集液的pH、溶解氧、電導(dǎo)率和氧化還原電位

    2.2 HCB濃度的動(dòng)態(tài)變化

    擬合得到線性回歸方程y=8 226.04x+28.536 6(r=0.999 9),方法最低檢測(cè)限為0.001 2 mg/L(圖1)。HCB在GC-MS處理26.33 min時(shí)出現(xiàn)最高峰,說(shuō)明GC-MS可用于HCB檢測(cè)。從表2看出,隨水培時(shí)間增加,培養(yǎng)香蒲的水體HCB的降解率呈先升后降趨勢(shì),水培20 d時(shí)達(dá)最大值68.2%,然后呈下降趨勢(shì)。各培養(yǎng)時(shí)段,對(duì)照營(yíng)養(yǎng)液中HCB濃度為0.928~0.957 mg/L,而香蒲水培液中HCB濃度為0.318~0.651 mg/L。表明,培養(yǎng)香蒲促進(jìn)水體HCB濃度較CK下降31.98%~66.53%。

    表2 HCB脅迫處理不同培養(yǎng)時(shí)間后HCB的濃度

    圖1 GC-MS測(cè)定HCB標(biāo)樣的色譜圖譜(a)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)

    2.3 HCB脅迫處理香蒲根系分泌次生代謝物的組分變化特征

    2.3.1 香蒲根系分泌次生代謝物的組分及其變化 從圖2看出,培養(yǎng)30 d后,各處理香蒲根系分泌物的GC-MS總離子流色譜的變化。HCB脅迫改變香蒲根系分泌次生代謝物的組分含量(圖3),其中,1-十二烯、α-細(xì)辛腦和苯甲酸乙酯含量變化較大。從表3看出,收集到的10種香蒲根系分泌次生代謝物包括1-十二烯、正十二烷、1-十三烯、正十四烷和α-細(xì)辛腦5種烴類,苯甲酸乙酯和鄰苯二甲酸二甲酯2種酯類,及α-畢橙茄醇、1H-3A,6-氫呋喃-2-酮-3-羧酸和油酸酰胺。HCB脅迫下香蒲根系分泌次生代謝物組分隨培養(yǎng)時(shí)間而動(dòng)態(tài)變化,培養(yǎng)1~5 d時(shí),HCB脅迫香蒲根系分泌1-十二烯、α-細(xì)辛腦和苯甲酸乙酯含量明顯低于對(duì)照(CK1)。培養(yǎng)10 d后,1-十二烯未檢出,苯甲酸乙酯含量也相應(yīng)減少。培養(yǎng)至15 d后,α-細(xì)辛腦含量達(dá)峰值,隨后急劇下降,且HCB脅迫下α-細(xì)辛腦含量下降速度較對(duì)照明顯加快。

    圖2 30 d后香蒲根系分泌物的GC-MS總離子流色譜

    圖3 HCB脅迫處理30 d后香蒲根系分泌物的GC-MS總離子流色譜

    表3 HCB脅迫處理不同培養(yǎng)時(shí)間香蒲根系分泌次生代謝物組分含量的動(dòng)態(tài)變化

    2.3.2 次生代謝物的組分含量與HCB降解率的相關(guān)性 由表4可知,α-畢橙茄醇、正十四烷和α-細(xì)辛腦含量均降低,分別下降25.7%、68.2%和96.5%。正十二烷、1H-3A,6-氫呋喃-2-酮-3-羧酸和油酸酰胺含量則顯著增加,分別增加27.2%、87.4%和112.6%。說(shuō)明,環(huán)境脅迫直接影響香蒲根系分泌次生代謝物組分進(jìn)而影響HCB的生物降解。對(duì)HCB降解率與香蒲根系分泌物進(jìn)行Pearson相關(guān)分析可知,相關(guān)系數(shù)r為-0.887~0.509,其中,HCB降解率與苯甲酸乙酯呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.887,P<0.01),表明,HCB脅迫下香蒲根系分泌物苯甲酸乙酯可抑制HCB降解。

    表4 水培30 d時(shí)香蒲根系分泌次生代謝物組分含量及其與HCB降解率的相關(guān)性

    3 討論

    根系分泌作用是適應(yīng)脅迫環(huán)境的一種重要方式,是根際生命共同體中連接水體-植物-微生物及其環(huán)境條件的重要樞紐。環(huán)境脅迫下,研究根系分泌物的組成和分泌規(guī)律,有助于了解根際效應(yīng)與脅迫環(huán)境的響應(yīng)關(guān)系[26]。一方面,根系分泌的某些胞外酶能夠直接參與污染物的降解過(guò)程;另一方面,根系分泌物通過(guò)塑造根際微生物組以驅(qū)動(dòng)植物逆境防御的反饋,調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性,進(jìn)而加速污染物降解[27]。此外,根系分泌的低分子有機(jī)酸、氨基酸等可改變根際代謝微域環(huán)境的pH,直接影響污染物的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程,影響污染物的去除[20,28]。TOYAMA等[7,21]已研究多環(huán)芳香烴與根系分泌物的共代謝作用,表明根系分泌物能夠選擇馴化形成特定的根際微生物群,促進(jìn)多環(huán)芳香烴的降解。鄭師章等[29]報(bào)道鳳眼蓮根系分泌物對(duì)根際細(xì)菌的降酚酶活性有積極影響,促進(jìn)了根際細(xì)菌的降酚效率。植物種類、生長(zhǎng)階段、根系分泌物和微生物可利用的碳源等影響根際微生物種類及活性,目前,根際污染生態(tài)過(guò)程及調(diào)控方向,核心根際微生物與根系分泌物組分間的關(guān)系還有待深入研究。

    HCB脅迫改變香蒲根系分泌物組分,抑制1-十二烯和1-十三烯2種烴類,苯甲酸乙酯和鄰苯二甲酸二甲酯2種酯類的分泌,水培30 d后未檢測(cè)到,根系調(diào)整烯烴類和酯類的分泌可能是適應(yīng)HCB脅迫的一種響應(yīng)機(jī)制。與張建聰?shù)萚30]水培沉水植物對(duì)面源污染物磷的響應(yīng)機(jī)制相一致。HCB降解率與苯甲酸乙酯呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.887,P<0.01),表明,HCB脅迫下香蒲根系分泌物苯甲酸乙酯抑制HCB降解率,可能是HCB生物降解過(guò)程中,香蒲根系分泌的苯甲酸乙酯被根際微生物消耗過(guò)快導(dǎo)致[31]。后期將進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

    4 結(jié)論

    研究結(jié)果表明,HCB脅迫初期,香蒲根系分泌物收集液的導(dǎo)電性增強(qiáng),氧化還原電位在37.3~88.2 mV變化。香蒲根系分泌次生代謝物經(jīng)GC-MS分析得到10種主要化合物,包含1-十二烯、正十二烷、1-十三烯、正十四烷和α-細(xì)辛腦共5種烴類,苯甲酸乙酯和鄰苯二甲酸二甲酯共2種酯類,及α-畢橙茄醇、1H-3A,6-氫呋喃-2-酮-3-羧酸和油酸酰胺。

    HCB脅迫水培30 d后,香蒲根系分泌次生代謝物組分發(fā)生改變,抑制1-十二烯、1-十三烯、苯甲酸乙酯和鄰苯二甲酸二甲酯的分泌,促進(jìn)正十二烷、1H-3A,6-氫呋喃-2-酮-3-羧酸和油酸酰胺顯著增加,分別較未受脅迫的對(duì)照(CK1)增加27.2%、87.4%和112.6%。α-畢橙茄醇、正十四烷和α-細(xì)辛腦含量均明顯降低,分別下降25.7%、68.2%和96.5%。

    HCB降解率與香蒲根系分泌物苯甲酸乙酯之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.887,P<0.01),表明,HCB脅迫影響香蒲根系分泌酯類含量,分泌次生代謝組分發(fā)生改變,進(jìn)而影響HCB的生物降解。

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