上海地區(qū)四種草莓病毒的檢測分析

劉 雅,楊 靜,張麗勍,李 斌,周艷孔,周 潔,高清華?,段 可

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所,上海201403;2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;3上海市金山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海201500;4上海市浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海201201;5上海市奉賢區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海201400)

草莓果實(shí)色澤艷麗、柔軟多汁、口感鮮美、芳香宜人,市場供應(yīng)持續(xù)時(shí)間長,種植效益高,已成為我國乃至世界各地廣泛栽培的重要特色園藝作物。截至2018年,我國草莓栽培面積達(dá)17.33萬hm2,總產(chǎn)量達(dá)500萬t,其中冷涼地區(qū)四季種植草莓面積達(dá)5 000 hm2,共選育品種112個(gè)[1]。草莓在上海地區(qū)進(jìn)行規(guī)?；N植已經(jīng)有30年以上,草莓果實(shí)應(yīng)季上市時(shí)節(jié)適逢我國幾個(gè)大的傳統(tǒng)節(jié)日,深受廣大市民喜愛,經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益俱佳,在上海郊區(qū)尤其是青浦、崇明、浦東、奉賢、金山、嘉定等區(qū)均有規(guī)?；N植。但目前上海郊區(qū)草莓生產(chǎn)中主栽品種是‘紅顏’和‘章姬’,經(jīng)過多年種植,出現(xiàn)抗病毒和抗病蟲能力差、育苗難、品質(zhì)下降等一系列問題,而其中草莓病毒病更是嚴(yán)重地影響了草莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

世界上已報(bào)道的草莓病毒有25種以上,主要通過蚜蟲、粉虱、線蟲、卵菌等傳播。其中,由蚜蟲傳播的草莓病毒病對草莓危害最為普遍[2-4],常見的有草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)、草莓斑駁病毒(SMoV)、草莓鑲脈病毒(SVBV)和草莓皺縮病毒(SCV)等。草莓植株一旦感染病毒多是代代相傳且具有潛隱性,只有多種病毒復(fù)合侵染時(shí)植株葉片才表現(xiàn)花葉、皺縮、褪綠黃化以及植株矮化等典型癥狀[5-6],造成生長結(jié)果能力下降;受單一病毒感染的草莓植株通常無癥狀,但產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。據(jù)報(bào)道,與健康植株相比,‘Camarosa’草莓植株受SMYEV感染后無癥狀的植株,其單株總果實(shí)數(shù)、商品果實(shí)數(shù)和單果重均顯著減少,下降達(dá)28%—63%;而且病毒復(fù)合感染植株的產(chǎn)量損失更大,與健康植株相比可減少78%—99%[7]。因此,在上海地區(qū)加快草莓脫毒種苗繁育及其應(yīng)用推廣是當(dāng)前草莓產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的迫切需要。

目前,對于上海地區(qū)草莓病毒病的種類和發(fā)生為害產(chǎn)區(qū)分布情況缺乏長期性、系統(tǒng)性跟蹤研究,本試驗(yàn)選取在我國南方地區(qū)為害嚴(yán)重的4種草莓病毒(SMoV、SMYEV、SVBV和SCV)作為檢測對象,采用RTPCR分子檢測技術(shù)測定這4種草莓病毒在上海郊區(qū)的發(fā)生情況,以期為草莓病毒病的有效防控提供指導(dǎo),進(jìn)一步為草莓脫毒種苗繁育及其應(yīng)用推廣提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年3—8月于上海市金山區(qū)(46份)、奉賢區(qū)(37份)、浦東新區(qū)(65份)共采集到137份疑似病毒癥狀病樣或病毒病典型癥狀材料,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與測定儀器

OMEGA植物RNA提取試劑盒(R6827-01)購自鄭州威展生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶購自上海博彩生物科技有限公司。

所用儀器包括ETC-811 PCR儀(東勝國際貿(mào)易有限公司)、Bio-Rad Powerpac電泳儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)和Tanon 3500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3 方法

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[8-9],委托生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成(表1)。

表1 4對草莓病毒特定引物序列Table 1 Specific primers sequences of four strawberry viruses

1.3.1 草莓總RNA提取和cDNA合成

按照RNA提取試劑盒說明書提取樣品總RNA,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,使用Thermo Scientific Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和含量測定。使用HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA的合成,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 病毒RT-PCR檢測

以上述cDNA為模板,利用SVBV,SMoV、SMYEV和SCV 4種病毒引物進(jìn)行RT-PCR檢測,RT-PCR程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。陽性對照為攜帶病毒特異片段的質(zhì)粒(pUC19為載體骨架)DNA,陰性對照為純水。取5μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)束后的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后,連同特異引物送往上海生工生物工程有限責(zé)任公司測序,所得序列用DNAMAN軟件與GenBank中對應(yīng)病毒基因組序列進(jìn)行多重序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海部分地區(qū)4種草莓病毒病的檢測與分布

在上海市金山、奉賢和浦東3個(gè)地區(qū)均檢測出含有SVBV和SMoV兩種病毒,但未檢測到SCV(圖1)。其中,SVBV在金山區(qū)采集病樣中檢出率最高達(dá)到58.7%;SMoV在金山區(qū)和奉賢區(qū)采集病樣中均有較高檢出率,均在60%以上;但是,SMYEV病毒僅在浦東新區(qū)采集樣品中檢測到,檢出率為1.5%。綜合統(tǒng)計(jì)分析來看,病毒總檢出率達(dá)到64.2%。在所檢測4種草莓病毒中,以SMoV總檢出率最高,達(dá)到43.8%。如表2所示,病毒總檢出率較高的采集地是金山區(qū)和奉賢區(qū),均在80%以上。4種病毒在各樣品采集地區(qū)的分布規(guī)律性不明顯,但不同地區(qū)采集樣品的檢出率差異明顯(表2)。

圖1 部分草莓樣品中4種病毒感染情況的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of four viruses in some strawberry samples

表2 不同地區(qū)各病原病毒檢出率Table 2 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions

2.2 檢測病毒陽性樣品測序分析

利用4種病毒的特異性引物對上海市金山、奉賢、浦東的137份樣品進(jìn)行RT-PCR檢測,SVBV、SMoV和SMYEV均擴(kuò)增得到單一且清晰條帶。其中SMYEV僅檢出1個(gè)陽性樣品,測序后與數(shù)據(jù)庫(No.D12517)比對,相似度為100%。對SVBV和SMoV檢出的多個(gè)陽性樣品,隨機(jī)抽取10個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物純化后測序,與數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)病毒序列進(jìn)行比較,樣品測序結(jié)果均顯示存在多個(gè)SNP(圖2)。

圖2 檢出草莓陽性病毒序列比對分析Fig.2 Alignment analysis of strawberry positive virus detected

SVBV所選陽性樣品中都存在11個(gè)位點(diǎn)的突變,所有樣品在SVBV基因組序列(NC.001 725.1)2 426 bp和2 512 bp處發(fā)生了AT突變,在2 444 bp和2 494 bp處發(fā)生了CT突變,在2 446 bp、2 495 bp、2 497 bp、2 500 bp以及2 530 bp處分別發(fā)生了AG、TC、GT、GA以及TG突變;樣品1-13在2 421—2 422 bp處由CC突變?yōu)門T,因此,SVBV病毒在上海地區(qū)至少存在2種不同的SVBV病毒小種(圖2)。

SMoV所選陽性樣品中,有4個(gè)樣品(1-24、3-7、3-11和3-9)存在10個(gè)位點(diǎn)的突變,在SMoV基因組序列(AJ.311 875.1)6 285 bp、6 290 bp、6 293 bp、6 295 bp以及6 297 bp處分別發(fā)生了AT、TC、TA、CT以及GA突變;樣品1-24、3-7和3-11在6 261—6 262 bp處發(fā)生了堿基置換(AT-TA),在6 304—6 305 bp處由TT突變?yōu)锳C;樣品3-9在6 262 bp和6 304 bp處均發(fā)生了TA突變,在6 305 bp處缺失了堿基T,因此,在上海地區(qū)至少有3種不同的SMoV病毒小種(圖2)。

2.3 上海地區(qū)4種草莓病毒病的分子檢測與表現(xiàn)癥狀綜合分析

田間采集的137份樣品中,除了帶有疑似病毒典型癥狀如皺縮、斑駁、失綠等,還包括疑似病害感染癥狀如葉片萎蔫、褐變或根深紅等。單一SVBV或SMoV感染材料多不具有典型病毒感染癥狀;SMov和SVBV復(fù)合感染率為21.2%,植株表現(xiàn)為生長勢弱,葉片表現(xiàn)不一,如斑駁、皺縮、失綠、葉脈褪綠、大小葉等(圖3)。

圖3 部分樣品病毒單一感染以及復(fù)合感染癥狀Fig.3 Symptoms of strawberry infected with single virus or multiple viruses

3 結(jié)論與討論

本研究選取上海3個(gè)地區(qū)共137份樣品中4種常見蚜蟲傳播病毒SVBV、SMoV、SMYEV以及SCV,采用RT-PCR分子檢測技術(shù)測定其在上海郊區(qū)的發(fā)生情況,結(jié)果顯示,感染SVBV和SMoV較為普遍,而SMYEV病毒僅在1份樣品中檢到,SCV未檢測到,說明后兩種病毒在上海地區(qū)比較少見或者不存在。

除單一病毒感染外,還有部分樣品受到復(fù)合感染,主要為SMoV和SVBV復(fù)合感染,可使草莓出現(xiàn)皺縮、斑駁、失綠等明顯癥狀。對比福建地區(qū)[10]和新疆地區(qū)[11]SMoV的檢測結(jié)果(分別為19.3%和23.78%),SMoV在上海地區(qū)的檢出率明顯較高,達(dá)到43.8%。本研究采樣中SVBV與SMoV的復(fù)合感染率也較高,達(dá)到21.2%,福建地區(qū)和新疆地區(qū)分別為12.9%和10.89%[10-11]。由此可見,這些常見病毒在我國普遍存在。另外,本研究采樣地上海金山、奉賢、浦東所有采集樣品中均未檢測出SCV,推測SCV在各地發(fā)生率低,或者是病毒變異導(dǎo)致先前的檢測引物不適用、待更新。

上海多數(shù)草莓種植戶仍采用自繁自育的傳統(tǒng)模式,多年連續(xù)栽培而從未采用脫毒種苗,導(dǎo)致草莓種苗質(zhì)量下降。另外,草莓種植戶多憑經(jīng)驗(yàn)而很少按照草莓標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)種植,不科學(xué)不規(guī)范的栽培管理措施加大了草莓感染病毒病的幾率,嚴(yán)重影響了草莓的產(chǎn)量和品質(zhì),導(dǎo)致草莓畸形果增多,病蟲害嚴(yán)重等[12]。因此,有效的草莓病毒病防控措施對草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要的意義。目前,上海市大力推動(dòng)草莓脫毒苗技術(shù)研發(fā),先后在草莓主產(chǎn)區(qū)包括青浦、浦東、奉賢建立脫毒苗原種圃、生產(chǎn)苗育苗基地,向全市及周邊地區(qū)提供優(yōu)質(zhì)種苗[13]。

田間雜草常常是草莓病毒的中間寄主,作為病毒傳播媒介的昆蟲通過田間雜草將病毒轉(zhuǎn)移到草莓植株上,感染后進(jìn)而造成其產(chǎn)量損失[14]。本研究中有35.8%的樣品未檢測出病毒感染,但卻表現(xiàn)有葉片腐爛,枯死,萎蔫,葉片邊緣焦黃,皺縮,葉片褐色等癥狀?？梢?除了感染炭疽菌等病原菌外,還有可能是土壤肥力過大,發(fā)生肥害而導(dǎo)致葉片皺縮干枯,葉片發(fā)黃甚至枯死[15];另外,有些葉片邊緣焦黃干枯的癥狀有可能是缺素導(dǎo)致的。因此,及時(shí)拔除病株、摘除病葉并進(jìn)行銷毀,增施有機(jī)肥料、合理施用化肥等對促進(jìn)草莓健壯生長,提高抗病毒能力均有一定的效果[16]。

隨著核酸測序技術(shù)和檢測技術(shù)的發(fā)展,越來越多的草莓病毒被發(fā)現(xiàn)。最近報(bào)道了一種新型蚜蟲傳播草莓細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒,暫命名為“草莓病毒1”(StrV-1),其感染癥狀為葉片不規(guī)則的褪綠以及花萼葉的增殖[17]。在栽培草莓中發(fā)現(xiàn)另一種新型病毒,暫命名為“草莓相關(guān)病毒1”(SaV1),并測定了其全基因組序列,SaV1N和L基因與9個(gè)已報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒的氨基酸序列同源性分別為32%—57%和38%—64%,歸類為細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬[18]。近年來,草莓環(huán)狀病毒3(SCrV-3),草莓環(huán)狀病毒4(SCrV-4),草莓白化病毒(SPaV)等在我國也相繼被報(bào)道[19-20]。另外,草莓病毒中還有一些少見的食源性病毒如諾如病毒,這類病毒很容易通過食物能進(jìn)入人體中,對人體健康造成威脅,甚至在人群中造成流行性疾病[21-22]。因此,草莓病毒病的防治對草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及人類健康都有著重要的意義。隨著越來越多新病毒被發(fā)現(xiàn),在栽培過程中病毒在植株體內(nèi)不斷積累,加之草莓病毒具有侵染途徑多樣、侵染方式復(fù)雜等特征,病毒防控工作也變得更加重要,新病毒一旦傳播開來,會(huì)對生產(chǎn)造成巨大的損失。因此,今后需要進(jìn)一步優(yōu)化病毒檢測方法、擴(kuò)展檢測對象,這對草莓病毒病的防控以及草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義。