不同類型改性粘土去除米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)后絮體中細菌變化特點

丁 玉,宋秀賢,曹西華,俞志明

(1.中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室,山東 青島 266071; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室,山東 青島 266237; 3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 4.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

赤潮是由生活在海水中的藻類大量增殖或聚集造成的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象[1],近年來,赤潮在我國近海海域頻繁出現(xiàn),對生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)殖業(yè)等造成嚴重危害。2000年以前,我國赤潮發(fā)生次數(shù)和累計面積相對較少。自2001年起,赤潮年發(fā)生次數(shù)維持在50次以上,其中,2012年在我國東南沿海一帶暴發(fā)的米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)赤潮對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了毀滅性的打擊,直接經(jīng)濟損失超過20億元[2]。

作為全球性的典型海洋生態(tài)災(zāi)害之一,赤潮從多個方面威脅著人類的生命安全,有關(guān)赤潮治理方法的研究眾多,但大多數(shù)方法因成本、生態(tài)效應(yīng)等問題仍停留在實驗室階段[3]。而改性粘土絮凝法作為一種應(yīng)急處置技術(shù),是目前可現(xiàn)場大規(guī)模應(yīng)用的赤潮治理方法,具有操作簡便、成本節(jié)約、環(huán)境友好等優(yōu)點。改性粘土除藻原理是通過改性粘土顆粒與赤潮藻細胞碰撞結(jié)合、發(fā)生絮凝,使赤潮藻細胞沉降到底層死亡,并對未絮凝的藻細胞造成損傷,從而達到有效消除和控制赤潮的目的[4]。

與赤潮藻自然消亡相比,改性粘土法作為一種重要的赤潮防控手段,可在短時間內(nèi)迅速沉降大量藻細胞至底層,絮凝后藻細胞的消亡分解問題一直備受關(guān)注。藻類的消亡分解過程除了受溫度、pH、營養(yǎng)鹽濃度等因素影響外[5],通常由細菌介導(dǎo)[6]。目前,關(guān)于細菌在藻類分解過程中的影響和作用等已有很多報道,例如,在分解的微囊藻(Microcystisspp.)細胞周圍發(fā)現(xiàn)有大量桿菌聚集[7]; 研究還發(fā)現(xiàn)在小球藻(Chlorellasp.)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)分解過程中異養(yǎng)菌優(yōu)勢群落從假單胞菌屬-產(chǎn)堿菌屬(Pseudomonas-Alcaligenes)轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍訔U菌屬-莫拉菌屬(Acinetobacter-Moraxella)[8]。

改性粘土法的高效絮凝作用使大量藻細胞在短時間內(nèi)脫離上層水體進入沉積物表面,這些沉積絮體中的藻源有機質(zhì)可能部分被粘土吸附封存于底層沉積物中,部分被細菌分解后進入水體。因此,改性粘土絮凝赤潮生物過程中細菌群落的變化值得關(guān)注與研究。本文通過室內(nèi)模擬實驗,探究典型赤潮生物——米氏凱倫藻在不同改性粘土絮凝后,底層絮體中細菌變化差異,揭示改性粘土治理赤潮后對底層環(huán)境中細菌群落的組成及功能的影響,同時結(jié)合相關(guān)水質(zhì)參數(shù),初步探討細菌群落變化與底層絮體中有機質(zhì)(TOC)含量的關(guān)系,以期進一步完善對改性粘土生態(tài)環(huán)境效應(yīng)的認識,為改性粘土治理赤潮的現(xiàn)場工作提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻培養(yǎng)及改性粘土制備

本研究選取我國近海典型的有毒赤潮藻——米氏凱倫藻為研究對象。藻種取自中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室藻種庫,在溫度(20±1) ℃、光照強度 50～60 μmol/(m2·s)、光暗比12 h∶12 h條件下進行培養(yǎng),后期實驗培養(yǎng)條件相同。所有實驗用具經(jīng)過5%HCl浸泡24 h后,在121 ℃下高溫滅菌30 min。培養(yǎng)實驗所用的海水取自青島膠州灣海域,經(jīng)0.45 μm混合纖維膜過濾、121 ℃高溫滅菌 30 min,冷卻至室溫后,加入無硅L1營養(yǎng)液[9]。

實驗所使用的粘土為廣西北海高嶺土,所采用的改性劑分別為聚合氯化鋁(PAC)和硫酸鋁(AS)。聚合氯化鋁改性粘土(MCⅠ)和硫酸鋁改性粘土(MCⅡ)的制備方法參照文獻[10-11]。本實驗利用16S rDNA的方法測定改性粘土的帶菌情況,多次濃縮提取 DNA后,PCR擴增均未獲得目的條帶,說明改性粘土自帶細菌量較低; 這可能是改性粘土的制備過程(包括水洗篩選、磁選凈化、高溫老化等十幾道工藝[4])使得材料本身的細菌含量較低,故在本文討論中暫不考慮粘土自帶細菌的影響。

1.2 實驗設(shè)計

將米氏凱倫藻培養(yǎng)至指數(shù)生長期,混合均勻后分別置于32個1 L的容器中,藻密度約為(3.08±0.30)×107個/L。分別加入 MCⅠ和 MCⅡ,使其最終質(zhì)量濃度均為 0.5 g/L,于 3 h(在圖中表示為 1 d)、3 d、5 d、7 d、11 d、16 d、21 d、26 d采集樣品,每組兩個平行樣。分層取樣,首先,于液面下3 cm處移取藻液10 mL,用于當(dāng)日測定藻密度,隨后,通過虹吸法吸出上層液體(940 mL),取其中 40 mL用于溶解態(tài)營養(yǎng)鹽(硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽)的測定,樣品經(jīng)三氯甲烷固定后凍于-20 ℃待分析。剩余50 mL液體與底層絮體充分混勻,15 mL絮體混合液經(jīng)飽和氯化汞固定后儲存于-20 ℃冰箱,用于測定總有機碳(TOC)。30 mL用于測定 16S rDNA,樣品于-80 ℃冰箱中儲存。5 mL樣品經(jīng)多聚甲醛(終濃度為1%)固定后儲存于-80 ℃冰箱中,用于細菌計數(shù)。

1.3 分析方法

1.3.1 細菌及藻細胞計數(shù)

將凍存的細菌樣品融化處理后,利用無菌 TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)緩沖液稀釋100倍(逐級稀釋)。通過SYBR Green I染色劑(按照體積比1∶10 000)避光染色 15 min后[12],上流式細胞儀(BD FACS Calibur,USA)進行檢測[13],利用內(nèi)含數(shù)量已知 Beads的絕對計數(shù)管(BD Trucount tubes,USA)確定細菌濃度,將細菌在坐標(biāo)軸上圈出來完成計數(shù)[14]。藻細胞計數(shù)的樣品用 Lugol試劑固定,在倒置顯微鏡(Olympus IX71,Japan)下進行鏡檢細胞計數(shù)。

1.3.2 16S rDNA

真空抽濾絮體懸濁液于 0.22 μm 的濾膜上,用OMEGA水樣提取試劑盒(D5525),按照使用說明書提取總 DNA,使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。將檢測合格的 DNA樣品送至諾禾致源生物信息科技有限公司,使用16S rDNA通用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和 806R(5′-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行目的基因擴增,基于 Ion S5TMXL技術(shù)測序平臺(Thermofisher),利用單端測序(single-end)的方法,完成16S V3-V4區(qū)域測序分析。

1.3.3 其他水質(zhì)參數(shù)

TOC通過總有機碳分析儀(Analytik jena Multi N/C 2100S,Germany)進行測定[15]。營養(yǎng)鹽濃度測定的方法參照《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T 12763.4—2007),銨鹽采用次氯酸鈉-苯酚法,硝酸鹽通過 Cd還原為亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法(重氮-偶氮法)[16],所有營養(yǎng)鹽樣品均用營養(yǎng)鹽自動分析儀(Skalar San++,Netherland)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

改性粘土對藻細胞的去除率計算公式如下:

其中,RE為去除率,N0和Nt分別為添加改性粘土前和取樣時間t時刻的藻細胞數(shù)量。

利用FlowJo軟件(TreeStar,USA)進行細菌數(shù)量的讀取和分析。使用 Qiime軟件(Version 1.7.0)計算Shannon指數(shù)。采用FAPROTAX(Functional Annotation of Prokaryotic Taxa)數(shù)據(jù)庫,基于16S rDNA測序所得的OTU分類表對細菌群落的功能進行注釋預(yù)測[17]。使用mothur軟件amova函數(shù)進行組間群落結(jié)構(gòu)差異性分析。通過 LEfSe軟件使用線性判別分析方法(linear discriminant analysis,LDA)進行組間差異物種篩選。運用Excel 2013和Origin 8.5對數(shù)據(jù)進行處理及繪圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 改性粘土對米氏凱倫藻的去除效果

實驗結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度(以下簡稱濃度)為0.5 g/L的MCⅠ能夠迅速沉降水體中約70%的藻細胞,在之后的10 d內(nèi)藻細胞密度雖有一定程度的反彈,但最高密度遠低于自然生長的對照組的藻密度(約 8×107個/L) (圖1)。加入 0.5 g/L 的 MCⅡ后,對米氏凱倫藻去除率將近100%,且隨時間推移并未出現(xiàn)再次增殖的現(xiàn)象。由此可見,同樣用量、不同類型改性粘土對同一種赤潮生物的去除率有較大差異,該結(jié)果與以往研究結(jié)果類似[18]。

圖1 不同處理組中米氏凱倫藻密度隨時間的變化情況Fig.1 Variation of K.mikimotoi density under contrasting systems

2.2 細菌密度、群落組成與功能預(yù)測

2.2.1 細菌密度

流式細胞儀測定結(jié)果表明,添加0.5 g/L的MCⅠ3 h后,絮體中細菌密度為(3.02±0.26)×1010個/L,此后持續(xù)增長至第 26 d (7.52±0.30)×1011個/L; 經(jīng) 0.5 g/L的MCⅡ處理3 h后,絮體中細菌密度為(7.51±1.28)×1010個/L,而后增長至第 26 d(5.18±0.30)×1011個/L(圖2)。

圖2 兩種類型絮體中細菌密度隨時間變化情況Fig.2 Variation of the bacterial density of flocs treated with two types of modified clay

2.2.2 細菌群落組成與多樣性

細菌16S rDNA高通量測序后,平均每個樣品測得37 008條有效序列。所有樣品的序列經(jīng)過聚類后共得到1 422個OTU(operational taxonomic unit,操作分類單元),經(jīng)物種注釋后共獲得 21個門、36個綱、82個目、159個科和 322個屬的細菌。在屬水平上,兩實驗組最大豐度排名前10的物種相對豐度如圖3所示。MCⅠ處理3 h后,絮體中細菌主要以Stenotrophomonas為主,且隨時間變化,Stenotrophomonas豐度逐漸降低,第26 d主要以Celeribacter和Altererythrobacter為主。添加MCⅡ后,絮體中優(yōu)勢菌屬同樣隨時間發(fā)生演替,由Altererythrobacter、Marivita、Fluviicola逐漸向Celeribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter轉(zhuǎn)變。選用Shannon指數(shù)評估不同改性粘土處理后絮體菌群的物種多樣性(圖4),MCⅠ組3 h的Shannon指數(shù)為0.44,而后逐漸升高至第26 d的4.93,MCⅡ組菌群多樣性指數(shù)由3 h的4.68降低至第11 d的2.43,此后第26 d回升至3.62。

圖3 屬水平最大豐度排名前10的細菌物種相對豐度圖Fig.3 Relative abundances of the top ten bacteria at the genus level

圖4 MCⅠ和MCⅡ組絮體中細菌的Shannon指數(shù)Fig.4 Bacterial Shannon index of MCⅠand MCⅡ flocs

2.2.3 細菌功能預(yù)測

根據(jù) 16S rDNA序列的分類注釋結(jié)果,采用FAPROTAX工具對MCⅠ和MCⅡ組的細菌群落功能注釋后,分別獲得57和53種功能分組,最大豐度排名前20的功能分組信息如圖5所示。從圖中可以看出,化能異養(yǎng)(包括 chemoheterotrophy和 aerobic chemoheterotrophy)功能相對豐度較高,在所有樣本中均有出現(xiàn)。另外,在MCⅠ組中,具有硝酸鹽還原(nitrate reduction)、硝酸鹽呼吸(nitrate respiration)、固氮(nitrogen respiration)功能的細菌相對豐度較高; MCⅡ組中,除了化能異養(yǎng)功能外,細菌發(fā)酵功能(fermentation)的相對豐度較高,后期還出現(xiàn)了較高比例的硫氧化(dark sulfur oxidation)、硫化合物氧化(dark oxidation of sulfur compounds)和亞硫酸鹽氧化(dark sulfite oxidation)方面的細菌功能。

圖5 不同改性粘土處理后,絮體中細菌功能相對豐度Fig.5 Relative abundances of bacterial function in flocs treated with different modified clays

2.3 主要水質(zhì)參數(shù)

本研究在分析不同處理組細菌密度和群落變化的同時,也監(jiān)測了主要水質(zhì)參數(shù)的變化情況。經(jīng)改性粘土處理后,MCⅠ組3 h絮體中TOC濃度為(151.35±16.23) mg/L,實驗前期略有下降,而后隨時間變化逐漸升高; MCⅡ組絮體TOC持續(xù)緩慢減少,由3 h的(203.18±2.69) mg/L 降至第 26 d(166.24±14.49) mg/L (圖6)。

圖6 不同改性粘土處理后,絮體TOC隨時間變化Fig.6 Changes of TOC in flocs after treatment with different modified clays over time

水體中硝酸鹽含量變化情況如圖7a所示,添加0.5 g/L的MCⅠ后,3 h水體中硝酸鹽含量為(467.00±11.35) μmol/L,而后隨時間變化持續(xù)降低至(262.15±5.86) μmol/L。加入 MCⅡ后,水體中硝酸鹽濃度為(460.30±6.59) μmol/L,一直降低至第 21 d 的(392.22±0.47) μmol/L,第 26 d 回升至(459.95±2.59) μmol/L。添加MCⅠ后,亞硝酸鹽濃度從(2.85±0.01) μmol/L增加到(35.09±4.12) μmol/L; 而 MCⅡ組亞硝酸鹽濃度變化幅度較小,在(1.41±1.94) μmol/L到(2.88±0.01) μmol/L范圍內(nèi)波動(圖7b)。添加0.5 g/L的MCⅠ后,水體中銨鹽濃度為(3.92±0.00) μmol/L,此后逐漸增加至(14.70±0.83) μmol/L。添加MCⅡ后,銨鹽濃度一直上升,至第 26 d 為(22.28±3.02) μmol/L (圖7c)。

圖7 不同改性粘土處理后,水體中溶解無機氮各組分變化Fig.7 Changes in dissolved inorganic nitrogen in water treated with two types of modified clay

3 討論

3.1 改性粘土對細菌密度的影響

海洋細菌作為重要的分解者,以多樣化的代謝活動參與海洋中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和分解過程,其密度是海洋微生物研究的關(guān)鍵參數(shù)。有不少研究表明,海洋細菌的密度[19-20]和群落結(jié)構(gòu)[21-22]與赤潮暴發(fā)關(guān)系密切,細菌與赤潮藻之間相互利用、相互選擇,形成特有的微生物群落結(jié)構(gòu)[23]。

改性粘土通過表面改性使原土表面由負電性轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦訹4],而細菌表面含有羧基和磷酸基團等,帶有大量負電荷[24],與表面帶正電的改性粘土顆粒易發(fā)生絮凝沉降。有研究發(fā)現(xiàn),在魚蝦養(yǎng)殖中可以使用粘土絮凝沉降細菌,以防止養(yǎng)殖生物幼體受到病原菌感染[25]。本研究中,由于不同類型改性粘土絮凝效果不同,MCⅡ?qū)γ资蟿P倫藻的去除率高于MCⅠ(圖1),可以推斷 MCⅡ?qū)毦男跄Ч哺哂贛CⅠ,致使3 h的MCⅡ組絮體中的細菌密度高于 MCⅠ組(圖2)。

細菌生長繁殖需要適宜的條件,如營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、水分、環(huán)境含氧量等[26],本研究中 MCⅠ和 MCⅡ組溫度等環(huán)境條件穩(wěn)定,造成細菌密度變化的主要差異來源于營養(yǎng)物質(zhì)。在后續(xù)的26天實驗中,底層絮體中細菌密度持續(xù)增加,這是由于沉積絮體含有大量的藻源有機質(zhì),為異養(yǎng)細菌提供了豐富的碳源等營養(yǎng)物質(zhì)[27]。Avnimelech[28]研究發(fā)現(xiàn),有機質(zhì)含量會影響細菌密度,隨著水體中 C/N的提高,異養(yǎng)細菌含量會顯著升高; Burford等[29]向養(yǎng)殖水體中添加有機碳,可以促進細菌的生長,消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì),從而可控制養(yǎng)殖水體的無機氮。本實驗中,同樣用量、不同類型改性粘土對米氏凱倫藻的去除率不同(圖1),致使底層絮體中有機質(zhì)含量不同(圖6),TOC含量的差異可能會影響后續(xù)細菌密度的變化。實驗前期(1～11 d),MCⅠ組絮體中細菌平均增長速率為 2.14×1010個/(L·d),而 MCⅡ組細菌平均增長速率為 3.44×1010個/(L·d)。由此可見,MCⅡ組底層絮體中較高的有機質(zhì)含量為 MCⅡ組中細菌的增殖提供了更好的環(huán)境條件,可能是導(dǎo)致 MCⅡ組細菌的生長率高于MCⅠ組的原因之一。在實驗后期(11～26 d),MCⅠ組絮體中細菌平均增長速率為3.38×1010個/(L·d),而MCⅡ組為 6.60×109個/(L·d),推測其原因可能是 MCⅠ組中再次生長的藻細胞進入衰亡期(圖1),水體中藻細胞死亡后沉降至底層,補充了絮體中藻源有機質(zhì)的含量,從而促進了MCⅠ組底層絮體中細菌的生長;而在 MCⅡ組后續(xù)的實驗過程里,絮體中無藻源有機質(zhì)補充,有機質(zhì)成為細菌生長的限制條件,使得細菌的增長速率減緩。

細菌的生長與繁殖需要消耗有機物,而 MCⅠ處理后米氏凱倫藻經(jīng)歷再次生長與死亡的過程,在實驗后期大量有機物沉降至底層,使得絮體中 TOC增長,所以,本研究對 MCⅠ組前期和 MCⅡ組的細菌增長速率與TOC消耗速率進行相關(guān)性分析(圖8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細菌增長速率與 TOC消耗速率呈正相關(guān)(P＜0.001),即 TOC消耗得越快,細菌增長越快。由此可見,MCⅠ與MCⅡ組中細菌密度變化與TOC含量密切相關(guān),絮體中TOC含量會影響細菌密度。

圖8 細菌增長速率與TOC消耗速率之間的相關(guān)性Fig.8 Correlation analysis between bacterial growth rate and TOC consumption rate

3.2 改性粘土對細菌群落組成及功能的影響

實驗結(jié)果顯示,不同類型改性粘土不僅能影響細菌密度,同時也會對細菌群落組成產(chǎn)生一定影響(圖3)。MCⅠ和MCⅡ組組間細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P＜0.001),通過 LEfSe分析(LDA score＞4)尋找 MCⅠ、MCⅡ組間差異顯著的物種,結(jié)果顯示,MCⅠ組的差異顯著的菌屬為Stenotrophomonas,MCⅡ組的差異物種有Celeribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter、Maribacter、Marivita、Alteromonas、Fluviicola(圖9)。

圖9 MCI和MCⅡ組絮體中細菌的LEfSe進化分支圖Fig.9 LEfSe analyses of MC I and MC II

MCⅠ組的細菌群落以Stenotrophomonas為主。該細菌為一種革蘭氏陰性菌,約0.5～1.5 μm,有若干極生鞭毛,形態(tài)為微彎曲或直的桿狀[30-31],在水和土壤等自然環(huán)境中廣泛分布[31],有的還存在于植物根系中,能夠參與固氮[32],有的能夠降解一些復(fù)雜有機物[31],該屬下的細菌大多耐藥且抗菌,可用來作為生物防治劑[33]。近年來,也曾多次在海洋環(huán)境中分離到該屬的細菌[34-35],陰盼晴[36]發(fā)現(xiàn)S.maitophilia可通過分泌胞外耐高溫活性物質(zhì)及胞外酶類抑制藻細胞存活,抑制赤潮藻錐狀斯式藻(Scrippsiella trochoidea)的生長。Stenotrophomonas還是一種耐鹵菌群,能夠在高濃度的 NaCl條件下存活[37]。另外,Stenotrophomonas能夠產(chǎn)生螯合鋁的有機酸和增加溶液pH值的多糖來降低鋁的毒性,因此該菌能夠耐受高濃度鋁[38-39]。在MCⅠ組中,絮體中細菌物種多樣性指數(shù)前期較低(圖4),一種Stenotrophomonas占主要優(yōu)勢,可能正是因為該類細菌對MCⅠ中的聚合氯化鋁具有一定耐受性,或者MCⅠ中的某些微量元素等綜合因素的影響刺激了Stenotrophomonas的生長,亦或未死亡米氏凱倫藻的影響。在MCⅠ組后期,絮體中菌群多樣性指數(shù)升高,Stenotrophomonas優(yōu)勢地位減弱,可能是由于米氏凱倫藻完全衰亡、或者MCⅠ中的某些微量元素耗盡等原因,該結(jié)果將在后續(xù)的實驗中進一步驗證。

在 MCⅡ組中,細菌群落結(jié)構(gòu)隨實驗時間增加逐漸變化,優(yōu)勢菌屬發(fā)生演替,由Altererythrobacter、Marivita、Fluviicola逐漸變?yōu)镃eleribacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter,推測該變化或與MCⅡ的改性劑——硫酸鋁有關(guān)。Fluviicola、Altererythrobacter、Marivita三種菌屬均為革蘭氏陰性菌,且為海水中常見的菌屬[40-42]。而隨實驗時間的進行,為適應(yīng) MCⅡ處理后的環(huán)境,細菌群落逐漸向Celeri-bacter、Muricauda、Sulfitobacter、Altererythrobacter等菌屬轉(zhuǎn)變。Celeribacter最早從海洋分離[43],是一種化能異養(yǎng)菌,能夠氧化硫代硫酸鹽[44],Sulfitobacter能夠產(chǎn)生亞硫酸鹽氧化酶,該屬細菌可參與亞硫酸鹽的氧化[45-46],而Altererythrobacter屬下細菌可通過歧化反應(yīng)降解硫代硫酸鹽[47]。硫是構(gòu)成生命物質(zhì)所必須的元素,它是一些必需氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和輔酶的組成成分,它的轉(zhuǎn)化過程較為復(fù)雜,由多種硫細菌完成[48]。在MCⅡ組中,實驗后期的菌屬大多能參與和硫相關(guān)的反應(yīng),推測 MCⅡ組沉積絮體中存在硫轉(zhuǎn)化的可能。

不同類型的改性粘土對細菌群落組成產(chǎn)生了不同的影響,同時也會在一定程度上影響細菌群落的功能。而細菌在有機物礦化分解中起著重要作用,其功能在一定程度上影響了海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動。經(jīng)FAPROTAX對細菌群落功能進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖5),在MCⅠ組中,具有硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸、固氮功能的細菌相對豐度較高,且上述功能在 MCⅠ和 MCⅡ組中存在顯著性差異(P＜0.05)。通過水質(zhì)參數(shù)變化發(fā)現(xiàn),MCⅠ組水體中硝酸鹽濃度降低、亞硝酸鹽濃度升高(圖7a,圖7b),推測其發(fā)生硝酸鹽還原過程。

相比 MCⅠ組,MCⅡ組中發(fā)酵作用的細菌功能相對豐度較高,后期還出現(xiàn)較高比例的硫、硫化合物和亞硫酸鹽氧化作用方面的細菌功能,上述功能在MCⅠ和 MCⅡ兩組間差異顯著(P＜0.05)。這可能與MCⅡ型改性粘土中改性劑有關(guān),而本實驗中并未進行與硫有關(guān)的水質(zhì)參數(shù)的測定,擬在今后的研究中進一步完善和深入。

另外,MCⅠ和 MCⅡ組中化能異養(yǎng)功能均占有較高比例,結(jié)合水質(zhì)參數(shù)發(fā)現(xiàn),MCⅠ、MCⅡ組中TOC在實驗前期均有所下降(圖6),由此可見,MCⅠ和 MCⅡ組絮體中不同的細菌群落對藻源有機質(zhì)進行了分解。此外,本研究中,MCⅠ組、MCⅡ組水體中銨鹽濃度均上升(圖7c),推測有機氮在異養(yǎng)菌的作用下發(fā)生了降解。海水中還原態(tài)氨氮主要是海洋生物代謝和死亡分解的終產(chǎn)物[49],有機氮可以直接脫氨基,氨基再與氫離子結(jié)合形成銨離子。

4 結(jié)論

1) 改性粘土處理后的26 d內(nèi),MCⅠ組和MCⅡ組絮體中細菌密度持續(xù)增長,且兩組間細菌的增長速率不同,這是由于不同類型改性粘土對米氏凱倫藻的去除率不同,使底層絮體中的有機質(zhì)含量不同,從而影響細菌的密度變化。

2) 不同類型改性粘土對細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同的影響,MCⅠ組絮體中細菌主要以Stenotrophomonas為主,MCⅡ組的優(yōu)勢種為Celeribacter、Muricauda、Altererythrobacter、Sulfitobacter等。通過 FAPROTAX功能預(yù)測發(fā)現(xiàn),MCⅠ組中的細菌具有較高豐度的硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸以及固氮等功能,MCⅡ組中硫氧化、硫化合物氧化、亞硫酸鹽氧化等與硫轉(zhuǎn)化有關(guān)的細菌功能占比較高。

致謝:感謝吳婷對實驗部分的幫助,感謝張悅對文章修改的建議,同時十分感謝各位審稿專家對本文提出的建設(shè)性的修改意見與建議。