• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    O.oeni糖苷酶活性對(duì)干白葡萄酒萜烯類香氣的影響

    2021-08-27 09:47:40趙丹丹李俊娥毛亞玲韓舜愈楊學(xué)山
    關(guān)鍵詞:萜烯糖苷糖苷酶

    祝 霞 趙丹丹 李俊娥 毛亞玲 韓舜愈 楊學(xué)山

    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730070; 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070)

    0 引言

    萜烯類化合物能夠賦予葡萄及葡萄酒典型的品種特征[1],它們?cè)谄咸殉墒爝^(guò)程中逐漸積累,并且以糖苷配基的形式直接連接在β-D-葡萄糖上形成單糖苷,連接有單糖苷配基的葡萄糖可進(jìn)一步與α-L-呋喃阿拉伯糖、α-L-吡喃鼠李糖、β-D-呋喃芹菜糖等鍵合生成雙糖苷或三糖苷[2]。糖苷測(cè)定分析表明,葡萄中的雙糖苷鍵合態(tài)香氣前體物含量最高,單糖苷次之,三糖苷最低[3],且鍵合態(tài)的糖苷類化合物只有轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的香氣成分才會(huì)被消費(fèi)者感知。單糖苷類香氣前體物質(zhì)可由β-葡萄糖苷酶直接酶解;雙糖苷化合物首先在α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶等外切酶的作用下生成β-D-葡萄糖單糖苷,然后在β-D-葡萄糖苷酶作用下釋放出具有揮發(fā)性的糖苷配基[4-5]。因此,特異性的單糖苷酶和雙糖苷酶被認(rèn)為是釋放萜烯類化合物的有效工具。

    釀酒酵母可以分泌糖苷酶,但在高糖、高酒精、高多酚以及低pH值的釀酒工藝條件下無(wú)法保持其高效的催化活性[6-7]。此外,一些非釀酒酵母也可以合成活力較高的β-葡萄糖苷酶,但其生長(zhǎng)僅局限于酒精發(fā)酵開(kāi)始階段,隨著酒精含量的增加,非釀酒酵母數(shù)量會(huì)急劇下降[8]。蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation,MLF)是釀造優(yōu)質(zhì)干紅和部分干白葡萄酒所必需的生產(chǎn)工藝[9],O.oeni菌株在生物降酸的同時(shí)還可以合成釋放糖苷酶,從而豐富和提升酒體的香氣品質(zhì)[9-13]。文獻(xiàn)[12]提出,評(píng)價(jià)優(yōu)良O.oeni菌株發(fā)酵特性時(shí),不能只局限于β-D-葡萄糖苷酶,還應(yīng)考慮α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的活性。文獻(xiàn)[14]研究表明,O.oeni糖苷酶具有較強(qiáng)的菌株依賴性,供試菌株中90%的菌株具有活性較高的α-L-鼠李糖苷酶,50%左右的菌株α-L-阿拉伯糖苷酶活性較高。因此,有必要對(duì)菌株合成糖苷酶特性進(jìn)行系統(tǒng)分析,以便在用于發(fā)酵劑之前進(jìn)行合理選擇。

    為了在日益全球化的葡萄酒市場(chǎng)中尋求獨(dú)特之處,分離篩選優(yōu)良本土O.oeni、釀造代表產(chǎn)區(qū)風(fēng)格的葡萄酒已成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[15-21]。本文以分離篩選的本土O.oeni菌株為試驗(yàn)對(duì)象,以商業(yè)菌株VP41為對(duì)照,探討各釀造因子對(duì)供試菌株糖苷酶活性的影響,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中菌株糖苷酶活性的變化,并在優(yōu)化后的釀造條件下進(jìn)行霞多麗干白葡萄酒MLF,分析比較MLF前后酒樣中萜烯類物質(zhì)的變化,以期為挖掘本土菌株釀造特性、生產(chǎn)代表河西走廊產(chǎn)區(qū)的葡萄酒提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本土酒酒球菌菌株:GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1菌株分離自甘肅省河西走廊產(chǎn)區(qū)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)自然啟動(dòng)MLF酒樣,由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行種屬鑒定。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示,GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1與模式菌株OenococcusoeniDSM 20252(T)相似度分別達(dá)到99.84%、99.34%、99.78%、99.58%。

    商業(yè)酒酒球菌:VP41,購(gòu)自上海杰兔責(zé)任有限公司。

    商業(yè)釀酒酵母:ES488,購(gòu)自意大利Enartis公司。

    釀酒葡萄:選用2019年產(chǎn)自甘肅省莫高葡萄種植基地的霞多麗葡萄,含糖量約為21.3°Brix,總酸質(zhì)量濃度6.87 g/L(以酒石酸計(jì)),pH值3.36。

    1.2 培養(yǎng)基與試劑

    酸性番茄培養(yǎng)基(ATB)配制參照文獻(xiàn)[16]的方法。

    參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行模擬汁培養(yǎng)基的配制:葡萄糖1 g/L、果糖1 g/L、L-蘋(píng)果酸2 g/L、海藻糖1 g/L、酒石酸1 g/L、檸檬酸1 g/L、乙酸鈉0.14 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO40.3 g/L、KCl 0.22 g/L、L-型半胱氨酸鹽酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015 g/L、CaCl20.065 g/L、甘油3 mL/L。

    香氣標(biāo)準(zhǔn)品:香茅醇、橙花醇、芳樟醇、α-松油醇、β-紫羅蘭酮、反式橙花叔醇等香氣化合物和內(nèi)標(biāo)物2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)。

    其他試劑:L-蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒(愛(ài)爾蘭Megazyme公司);對(duì)硝基苯酚(p-NP)、對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)、4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(上海源葉有限責(zé)任公司);氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、碳酸鈉,均為分析純?cè)噭?天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

    1.3 儀器與設(shè)備

    SPX-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);pHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁責(zé)任有限公司);TU-1810型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司); SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);GZX-GF101-Ⅱ型恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);H2050R型高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司)。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

    參照文獻(xiàn)[22]的方法并略作修改。當(dāng)p-NP濃度在10~80 μmol/L范圍時(shí),400 nm處OD值與濃度回歸方程為:y=0.007 6x+0.019 9,R2=0.997 4,線性關(guān)系良好,可用作后續(xù)試驗(yàn)中糖苷酶活性的計(jì)算。

    1.4.2菌種活化

    參照文獻(xiàn)[20]的方法挑取斜面上保存的菌種置于滅菌后的ATB培養(yǎng)基內(nèi),在28℃下培養(yǎng),待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)(600 nm處OD值約1.1),進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)接種。

    1.4.3糖苷酶活性測(cè)定方法

    (1)β-D-葡萄糖苷酶活力

    參照文獻(xiàn)[14]的方法并略作修改。以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物,反應(yīng)體系(2.5 mL)為:從模擬汁培養(yǎng)基中取1 mL的培養(yǎng)液,加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.5 mLp-NPG溶液,混合后于50℃條件反應(yīng)30 min,然后8 000 r/min離心15 min,取上清液,加入2 mL的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    酶活力單位(U)定義為:每1 min每1 mL菌體細(xì)胞水解相應(yīng)底物生成p-NP所需要的酶量(μmol)。

    (2)α-L-鼠李糖苷酶活力

    參照文獻(xiàn)[23]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷為底物,反應(yīng)體系(3.5 mL)為:取0.4 mL的培養(yǎng)液,加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液,混合后于50℃條件下反應(yīng)30 min后8 000 r/min離心15 min,取上清液,加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    (3)α-L-阿拉伯糖苷酶活力

    參照文獻(xiàn)[24]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷為底物,反應(yīng)體系(2.1 mL)為:取0.4 mL的培養(yǎng)液,加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液,混合后于50℃條件下反應(yīng)30 min,然后8 000 r/min離心15 min,取上清液,加入0.6 mL飽和硼砂溶液終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    1.4.4本土酒酒球菌菌株酶活力評(píng)價(jià)

    利用模擬汁體系對(duì)4株本土O.oeni及1株商業(yè)O.oeni菌株的3種糖苷酶(β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶)活力進(jìn)行測(cè)定,分析比較供試菌株酶活性變化規(guī)律,篩選產(chǎn)酶活性較高的菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

    1.4.5各釀造因子對(duì)菌株糖苷酶活性的影響

    (1)初始pH值

    將鑒定所得O.oeni菌株經(jīng)ATB斜面培養(yǎng)、ATB液體培養(yǎng)基活化后,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供試菌株以1×107CFU/mL的接種量,分別接種于pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8的模擬汁培養(yǎng)基中(HCl或NaOH調(diào)整pH值),28℃靜置培養(yǎng),每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶活性。試驗(yàn)重復(fù)3次,下同。

    (2)乙醇體積分?jǐn)?shù)

    將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的O.oeni菌株,以1×107CFU/mL的接種量分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%、8%、10%、12%、14%的模擬汁培養(yǎng)基中,28℃靜置培養(yǎng),每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

    (3)發(fā)酵溫度

    待O.oeni菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以1×107CFU/mL的接種量接種于模擬汁培養(yǎng)基中,分別置于18、20、22、25、28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

    (4)SO2添加量

    以1×107CFU/mL的接種量,將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的O.oeni菌株,分別接種于SO2添加量(亞硫酸鈉調(diào)節(jié))為15、30、45、60、75 mg/L的模擬汁培養(yǎng)基中,28℃靜置培養(yǎng),每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

    1.4.6復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度、SO2添加量4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

    1.4.7微釀試驗(yàn)

    菌株活化:參考廠家說(shuō)明書(shū)推薦方法進(jìn)行釀酒酵母菌株活化。按推薦用量(0.2 g/L)將ES488干酵母菌粉溶于10倍體積無(wú)菌水中,37℃靜置溶解20 min,再加入等體積的葡萄汁于28℃活化25 min。酒酒球菌菌株活化參照1.4.2節(jié)的方法進(jìn)行。

    葡萄酒微釀試驗(yàn):參照文獻(xiàn)[25]完成霞多麗干白葡萄酒酒精發(fā)酵后,選擇產(chǎn)酶性能優(yōu)良的O.oeni菌株,按1×107CFU/mL的接種量進(jìn)行接種,以商業(yè)菌VP41作為對(duì)照。自接入菌株開(kāi)始,每隔48 h取樣,測(cè)定L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度,小于0.2 g/L時(shí)結(jié)束MLF。取樣測(cè)定理化指標(biāo)和萜烯類香氣化合物。

    理化指標(biāo)測(cè)定:酒精度、殘?zhí)呛?、pH值、總酸含量、揮發(fā)酸含量和總SO2含量檢測(cè)均參照文獻(xiàn)[26]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行。L-蘋(píng)果酸含量測(cè)定參考L-蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    揮發(fā)性香氣化合物含量的測(cè)定:參照文獻(xiàn)[25]的香氣物質(zhì)萃取方法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)條件,進(jìn)行香氣成分富集和定性定量分析。于15 mL的頂空瓶中加入2.5 g氯化鈉、8 mL酒樣、20 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度81.06 mg/L),加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后封口,放入恒溫加熱磁力攪拌器中,40℃水浴平衡30 min,然后插入萃取針頂空萃取30 min。

    (1)GC-MS條件

    GC條件:色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm,不分流進(jìn)樣;載氣(He)流速1 mL/min;進(jìn)樣口溫度240℃,解析時(shí)間5 min;柱溫升溫程序:50℃保持5 min,以3.5℃/min升至180℃,保持15 min。

    MS條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度180℃;離子源溫度200℃;質(zhì)譜掃描范圍50~350(質(zhì)荷比)。

    (2)定性與定量分析

    定性分析:采用與標(biāo)準(zhǔn)香氣成分保留時(shí)間(RT)對(duì)比的方法結(jié)合NIST-11、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索比對(duì)結(jié)果進(jìn)行揮發(fā)性香氣化合物定性分析。

    定量分析:對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣化合物通過(guò)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析,其他香氣化合物含量利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量分析,內(nèi)標(biāo)物為2-辛醇。

    1.4.8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

    對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010、Origin 2018進(jìn)行基本處理和制圖,IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行多重比較(Duncan法,P<0.05)及差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性測(cè)定

    分別將供試菌株接種于模擬汁培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,每隔48 h取樣,測(cè)定酶活力。由于MLF在14 d時(shí)基本結(jié)束,發(fā)酵過(guò)程中共需取樣7次,且所測(cè)酶種類較多(3種),為便于直觀比較各菌株的酶活性,參照文獻(xiàn)[27]的方法,采用酶活力累積量(mU/mL),即同一菌株、同一種酶的7次測(cè)定結(jié)果逐次相加,表征分析不同菌株之間的差異(表1),下同。

    表1 5株O.oeni糖苷酶活性測(cè)定

    由表1可知,對(duì)4株供試本土O.oeni的3種糖苷酶活性比較發(fā)現(xiàn),菌株GF-2、ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶活性最高值都分別顯著高于菌株QL-11、MG-1的最大酶活性(P<0.05)。QL-11、MG-1的3種酶活性測(cè)定值都低于菌株VP41的酶活性。因此,選擇菌株GF-2、ZX-1為后續(xù)的測(cè)試菌株。

    2.2 各發(fā)酵條件對(duì)本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性的影響

    結(jié)合態(tài)香氣雙糖苷酶解時(shí),首先由雙糖苷酶作用于相應(yīng)的阿拉伯糖、鼠李糖基等糖基配體,使雙糖苷變?yōu)閱翁擒?;然后再由?D-葡萄糖苷酶斷裂糖苷鍵,生成游離芳香苷元和葡萄糖[28]。因此采用雙糖苷酶活力累積量(mU/mL)(α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶活力累積量之和)和β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(mU/mL),分別直觀表征在不同發(fā)酵條件下供試菌株之間的糖苷酶活性差異。

    2.2.1初始pH值

    由圖1(圖中不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平下組內(nèi)(相同橫坐標(biāo)、不同圖例)差異顯著,不同大寫(xiě)字母表示在P<0.05水平下組間(相同圖例、不同橫坐標(biāo))差異顯著,下同)所示,隨著pH值的增加,供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶活力累積量都呈現(xiàn)增加趨勢(shì),且菌株VP41的2種酶活性低于菌株ZX-1、GF-2的酶活性。供試菌株在pH值為3.6或3.8時(shí)具有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量,且在不同的pH值梯度下,菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力比ZX-1和VP41的酶活性顯著較高。VP41的最大雙糖苷酶活力累積量(19.440 mU/mL)出現(xiàn)在pH值為3.8,ZX-1、GF-2的最大雙糖苷酶活力累積量則是在pH值為3.6時(shí)產(chǎn)生(32.964、22.718 mU/mL)。當(dāng)初始pH值為3.0時(shí),VP41比ZX-1表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶活特性;除pH值3.0以外,菌株ZX-1的雙糖苷酶活性在不同pH值下都顯著高于其它供試菌株(P<0.05)。

    2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)

    由圖2可知,不同菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)影響下的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。本土O.oeni菌株ZX-1、GF-2在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)產(chǎn)生最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(24.570、30.166 mU/mL),對(duì)照菌株VP41的最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)產(chǎn)生(17.202 mU/mL),且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%~8%時(shí),VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%~12%時(shí),菌株GF-2的雙糖苷酶活力累積量均高于菌株ZX-1和VP41的酶活力累積量,但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到14%時(shí),VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于2株本土O.oeni,表明商業(yè)菌株VP41在較高乙醇體積分?jǐn)?shù)的葡萄酒中更有利于品種香的釋放。此時(shí),GF-2的雙糖苷酶活力累積量顯著下降,與ZX-1無(wú)顯著差異(P<0.05)。

    2.2.3SO2添加量

    圖3為SO2添加量對(duì)供試菌株糖苷酶活力的影響。供試菌株在SO2添加量為30 mg/L時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量,且GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(30.933 mU/mL)顯著高于ZX-1和VP41菌株;SO2添加量為45~75 mg/L時(shí),ZX-1與VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量差異不顯著(P<0.05)。在SO2添加量為15~45 mg/L時(shí),ZX-1的雙糖苷酶活力累積量顯著高于GF-2和VP41,當(dāng)SO2添加量為60~75 mg/L時(shí),商業(yè)菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于本土O.oeni。

    2.2.4發(fā)酵溫度

    發(fā)酵溫度是葡萄酒釀造過(guò)程中最可控的因素之一,不適宜的發(fā)酵溫度會(huì)導(dǎo)致雜菌的生長(zhǎng),從而破壞葡萄酒的感官質(zhì)量[10]。O.oeni的最適生長(zhǎng)溫度是25~28℃,而葡萄酒的MLF溫度為18~22℃,綜合考慮,選擇在18~28℃不同的溫度下,對(duì)菌株酶活性變化情況進(jìn)行測(cè)定分析。

    由圖4可知,在不同發(fā)酵溫度下,本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。菌株VP41在22℃時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(60.637 mU/mL),而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產(chǎn)生,且菌株ZX-1和GF-2的最大酶活性沒(méi)有顯著性差異(P<0.05)。雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長(zhǎng)溫度,但28℃時(shí)本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低。菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產(chǎn)生(29.695 mU/mL)。本土O.oeni菌株在22℃時(shí)雙糖苷酶活力累積量最小,最大酶活性在18℃時(shí)產(chǎn)生。

    2.3 復(fù)合發(fā)酵條件下菌株酶活性的測(cè)定

    葡萄酒釀造過(guò)程中,多個(gè)發(fā)酵參數(shù)會(huì)協(xié)同影響O.oeni的生長(zhǎng),O.oeni對(duì)葡萄酒生境的耐受能力決定著MLF的進(jìn)展程度。因此,在復(fù)合發(fā)酵條件下測(cè)定供試菌株的酶活性,對(duì)依據(jù)釀造風(fēng)格選擇MLF菌株更具有參考價(jià)值[28]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,pH值選取3.4、3.6、3.8共3個(gè)水平,雖然較高濃度的乙醇會(huì)抑制O.oeni的生長(zhǎng),但大部分干型葡萄酒的酒精度在10~15%vol之間,為了模擬真實(shí)的葡萄酒環(huán)境,結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、12%和14%共3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。結(jié)合干型葡萄酒釀造工藝的要求,選擇SO2添加量為30、45、60 mg/L進(jìn)行復(fù)合因子發(fā)酵試驗(yàn)。28℃是O.oeni菌株生長(zhǎng)的較佳培養(yǎng)溫度,但過(guò)高的發(fā)酵溫度存在揮發(fā)酸過(guò)量的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此,結(jié)合葡萄酒MLF的實(shí)際情況,在復(fù)合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)選擇發(fā)酵溫度為18、20、22℃。

    2.3.1β-D-葡萄糖苷酶活性

    由表2可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí),供試菌株有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量,分別為22.716 mU/mL(ZX-1)、23.990 mU/mL(GF-2)、23.506 mU/mL(VP41);當(dāng)SO2添加量為30 mg/L時(shí),ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為25.507 mU/mL,GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為27.914 mU/mL,VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為29.529 mU/mL;與pH值3.4、3.8相比,pH值為3.6時(shí),供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量達(dá)到最大值,且在發(fā)酵溫度22℃時(shí),菌株的酶活性也較好。

    表2 β-D-葡萄糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

    從極差R可以看出,不同發(fā)酵因素對(duì)菌株ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、發(fā)酵溫度、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù);對(duì)菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度;對(duì)VP41菌株β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值。

    由表3可知,SO2添加量對(duì)供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性有極顯著影響(P<0.01)。pH值、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株ZX-1和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05);pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

    表3 β-D-葡萄糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)方差分析

    2.3.2雙糖苷酶活性

    在復(fù)合發(fā)酵條件下,菌株的雙糖苷酶活性表現(xiàn)出相似性,即在乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、SO2添加量為30 mg/L、pH值3.6、發(fā)酵溫度22℃的條件下,具有最大的雙糖苷酶活力累積量。由表4可知,供試菌株的雙糖苷酶活力累積量有差異,從大到小依次為GF-2(46.576 mU/mL)、ZX-1(46.806 mU/mL)、VP41(36.774 mU/mL)。

    表4 雙糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

    從極差R可以看出,不同發(fā)酵因素對(duì)菌株ZX-1雙糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度;對(duì)菌株GF-2雙糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度;對(duì)菌株VP41雙糖苷酶活性影響從大到小依次為:SO2添加量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度、pH值。

    由表5可知,SO2添加量對(duì)供試菌株的雙糖苷酶活性影響極顯著(P<0.01)。pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株ZX-1和GF-2的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05);發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株VP41的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

    表5 雙糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)方差分析

    2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,選擇受試組中β-D-葡萄糖苷酶活性和雙糖苷酶活性最高的發(fā)酵條件,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、pH值為3.6、SO2添加量為30 mg/L、發(fā)酵溫度為22℃的復(fù)合條件下,將發(fā)酵菌株分別接種于模擬汁中,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),平行重復(fù)3次。結(jié)果表明ZX-1、 GF-2和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量平均值分別為30.020、29.884、33.032 mU/mL,雙糖苷酶活力累積量平均值分別為45.932、46.137、37.011 mU/mL,均高于正交試驗(yàn)其他處理組。由此確定在該條件下進(jìn)行霞多麗干白葡萄酒MLF,并進(jìn)行萜烯類物質(zhì)檢測(cè)分析。

    2.5 微釀試驗(yàn)

    2.5.1MLF后葡萄酒理化指標(biāo)

    霞多麗干白葡萄酒的基本理化指標(biāo)見(jiàn)表6。由表6可知,各酒樣中L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度均小于0.2 g/L,表明MLF成功完成。pH值升高0.11~0.16,總酸質(zhì)量濃度降低2.48~2.62 g/L。揮發(fā)酸含量雖然有所升高,但質(zhì)量濃度最大值為0.42 g/L(<1.2 g/L),均符合GB/T 15037—2006的要求。供試本土O.oeni菌株在第12天完成MLF,商業(yè)菌株VP41則在第14天完成MLF。

    表6 蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵前后干白葡萄酒樣理化指標(biāo)

    2.5.2萜烯類化合物GC-MS檢測(cè)

    不同處理?xiàng)l件下,各處理組中萜烯類化合物含量的變化情況見(jiàn)表7。ZX-1處理組中萜烯類物質(zhì)的總含量最高,質(zhì)量濃度為515.897 μg/L,而VP41處理組中的萜烯類物質(zhì)種類最多(11種)。2.3節(jié)的研究表明,雖然在不同復(fù)合條件下,菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni(P<0.05),但其β-D-葡萄糖苷酶在最優(yōu)復(fù)合條件下顯著高于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。萜烯類物質(zhì)在葡萄果實(shí)中主要以雙糖苷的形式存在,在葡萄酒中雙糖苷酶作用生成的單糖苷物質(zhì)由β-D-葡萄糖苷酶進(jìn)一步水解,生成游離態(tài)的萜烯類物質(zhì)。本土O.oeni發(fā)酵后的酒樣中雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣,但酒樣中的總含量卻較高,α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度高于其閾值,具有潛在的花香味。

    表7 各處理酒樣中萜烯類物質(zhì)含量的變化

    3 討論

    3.1 釀造因子對(duì)O.oeni糖苷酶活性的影響

    一些葡萄酒成分,如糖和乙醇,或釀酒過(guò)程中的溫度和pH值等因素均會(huì)影響糖苷的活性[14]。本試驗(yàn)選擇糖苷酶活性表現(xiàn)較好的2株本土O.oeni(GF-2、ZX-1)和商業(yè)菌株VP41,分析初始pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2添加量、發(fā)酵溫度等對(duì)菌株的糖苷酶活特性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同釀造因子對(duì)同一菌株的糖苷酶活性影響不同,且存在著顯著差異(P<0.05)。文獻(xiàn)[2]研究表明,pH值是抑制O.oeni菌株酶活性的重要因子,與菌株酶活性呈正相關(guān),這與本試驗(yàn)中供試菌株在pH值為3.6~3.8時(shí),菌株的酶活力累積量最高的結(jié)果相一致。同時(shí)在本試驗(yàn)中當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%~8%時(shí),菌株糖苷酶活性最大;乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%~14%時(shí),糖苷酶活性緩慢下降,與文獻(xiàn)[29]中乙醇影響O.oeni菌株的生長(zhǎng)參數(shù),卻不影響酶活性的研究結(jié)果存在差異??赡苁且?yàn)橐掖几淖兞思?xì)胞膜的通透性,從而使胞內(nèi)酶和底物之間更容易接觸[14]。同時(shí)酶活性的降低可以解釋為蛋白質(zhì)變性的結(jié)果。文獻(xiàn)[16]的研究強(qiáng)調(diào)了添加SO2可能有助于調(diào)節(jié)MLF期間O.oeni的糖苷酶活性,本研究發(fā)現(xiàn)菌株在30 mg/L時(shí)有最大酶活性,得到了類似的結(jié)果。發(fā)酵溫度是葡萄酒釀造過(guò)程中最可控的因素之一,菌株VP41在22℃時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活性,而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產(chǎn)生,雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長(zhǎng)溫度,但本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低;菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產(chǎn)生,本土O.oeni菌株最大雙糖苷酶活性在18℃產(chǎn)生,這提示在葡萄酒實(shí)際生產(chǎn)中,應(yīng)根據(jù)發(fā)酵菌株特點(diǎn)選擇最適宜的發(fā)酵溫度。

    3.2 O.oeni對(duì)葡萄酒萜烯類物質(zhì)的影響

    萜烯類化合物氣味閾值低、風(fēng)味強(qiáng)烈、感官特征明顯,主要以糖苷態(tài)的形式存在于葡萄果皮中。O.oeni在MLF過(guò)程中降低葡萄酒酸度的同時(shí)伴隨著一系列的代謝活動(dòng),其中大量的酶代謝使得產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物濃度遠(yuǎn)超過(guò)其閾值,致使葡萄酒香氣濃郁度增加。本試驗(yàn)接種不同O.oeni菌株分別對(duì)霞多麗干白葡萄酒進(jìn)行MLF,結(jié)果表明本土菌株處理的酒樣雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣,但酒樣中的總含量卻較高,α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的含量高于其閾值,這與菌株具有的糖苷酶活性及類型有關(guān)。文獻(xiàn)[30]發(fā)現(xiàn),MLF后酒樣中β-大馬士酮的濃度明顯增加,表明該化合物的形成可能與參與的菌株的水解活性有關(guān)。文獻(xiàn)[15]發(fā)現(xiàn)接種O.oeniMS46的葡萄酒MLF后的酒樣中形成了β-香茅醇(柑橘香味),可能是經(jīng)菌株MS46的糖苷酶對(duì)底物釋放后合成。本研究正如預(yù)期,MLF后萜烯類化合物質(zhì)量濃度明顯增加,與文獻(xiàn)[11]的結(jié)果相一致。

    4 結(jié)論

    (1)在單因素條件下,供試菌株糖苷酶活性變化趨勢(shì)具有菌株相似性,在不同梯度條件下產(chǎn)酶活性具有一定的菌株差異性。當(dāng)pH值為3.6時(shí)本土O.oeni菌株的糖苷酶活性均具有最大酶活性,且菌株ZX-1、GF-2的兩種酶活性高于商業(yè)菌株VP41的酶活性;乙醇體積分?jǐn)?shù)在6%~8%時(shí),供試菌株的糖苷酶都有最大酶活性;SO2添加量為30 mg/L時(shí),供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶的酶活性均達(dá)到峰值;本土O.oeni的β-D-葡萄糖苷酶在20℃時(shí)產(chǎn)生的酶活性最高,菌株VP41在22℃下酶活性有最大值。復(fù)合釀造因子試驗(yàn)結(jié)果表明,在pH值3.6、乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、SO2添加量為30 mg/L、發(fā)酵溫度為22℃的發(fā)酵條件下,供試菌株均有最大酶活力累積量,但本土O.oeni菌株的糖苷酶活力累積量高于商業(yè)菌株VP41。

    (2)霞多麗干白葡萄酒微釀試驗(yàn)結(jié)果表明,供試本土菌株具有良好的L-蘋(píng)果酸降解能力。萜烯類化合物GC-MS分析結(jié)果顯示,本土O.oeniZX-1發(fā)酵后的酒樣中雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣,但酒樣中的總含量卻最高(質(zhì)量濃度515.897 μg/L),α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度高于其閾值,具有潛在的花香味,這與供試菌株的風(fēng)味酶活性累積量變化規(guī)律相一致。

    猜你喜歡
    萜烯糖苷糖苷酶
    4-萜烯醇對(duì)沙門菌的抗菌機(jī)制
    漫步在森林當(dāng)中為何讓人感覺(jué)心情舒暢?
    輻射松與杉木在高溫干燥中萜烯類釋放濃度研究*
    知母中4種成分及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    一種改性萜烯酚樹(shù)脂及其制備方法及其在輪胎胎面膠中的應(yīng)用
    木蝴蝶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    甜葉菊及其糖苷的研究與發(fā)展探索
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:47
    利用烷基糖苷遷移和擴(kuò)張共軛亞油酸囊泡pH窗口
    固體超強(qiáng)酸催化合成丁基糖苷
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    伦精品一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人精品婷婷| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产 精品1| 91成人精品电影| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜91福利影院| 成人二区视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av男天堂| 在线观看免费高清a一片| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产精品免费视频内射| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久国产精品麻豆| 中文欧美无线码| www.精华液| 亚洲精品国产av成人精品| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品一二三| 天天操日日干夜夜撸| 极品人妻少妇av视频| 黄色怎么调成土黄色| 免费黄色在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 天堂中文最新版在线下载| 91国产中文字幕| av又黄又爽大尺度在线免费看| 大片免费播放器 马上看| 久热久热在线精品观看| 在线天堂中文资源库| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产男女内射视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 热99久久久久精品小说推荐| 最新的欧美精品一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 超碰成人久久| 精品视频人人做人人爽| 国产精品 国内视频| 精品久久蜜臀av无| 亚洲综合精品二区| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品一区二区免费观看| 精品久久久精品久久久| 在线观看人妻少妇| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费在线观看黄色视频的| 我的亚洲天堂| 国产精品蜜桃在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 搡老乐熟女国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 男女边吃奶边做爰视频| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美在线黄色| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99久久综合免费| 午夜精品国产一区二区电影| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇人妻 视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 999精品在线视频| 国产毛片在线视频| 久久精品国产自在天天线| xxxhd国产人妻xxx| 丝袜在线中文字幕| 国产成人精品在线电影| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| av电影中文网址| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 精品午夜福利在线看| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲国产精品国产精品| 老司机影院毛片| 日韩中文字幕视频在线看片| 在现免费观看毛片| 国产xxxxx性猛交| 制服丝袜香蕉在线| 色哟哟·www| 精品久久久精品久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产成人91sexporn| 99九九在线精品视频| 伊人久久国产一区二区| 国产福利在线免费观看视频| 制服人妻中文乱码| 男人舔女人的私密视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 女人精品久久久久毛片| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩伦理黄色片| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品国产露脸久久av麻豆| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美av亚洲av综合av国产av | 女人精品久久久久毛片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 男的添女的下面高潮视频| 国产激情久久老熟女| 人妻少妇偷人精品九色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 少妇人妻 视频| 亚洲国产最新在线播放| 成年女人在线观看亚洲视频| 香蕉国产在线看| 久久久久久久精品精品| 十八禁高潮呻吟视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| √禁漫天堂资源中文www| 少妇 在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 大香蕉久久成人网| 好男人视频免费观看在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 边亲边吃奶的免费视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品午夜福利在线看| 欧美精品亚洲一区二区| 大香蕉久久网| 国产男女内射视频| 亚洲成人一二三区av| 九草在线视频观看| av片东京热男人的天堂| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲视频免费观看视频| 一区在线观看完整版| 在线观看免费高清a一片| 国产野战对白在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜福利视频精品| 一区福利在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 国产在视频线精品| 黄片小视频在线播放| 男人操女人黄网站| 不卡av一区二区三区| 久久这里有精品视频免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 毛片一级片免费看久久久久| 国产av一区二区精品久久| 国产精品成人在线| 久久精品国产综合久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 中国国产av一级| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av不卡在线播放| 秋霞伦理黄片| 最新中文字幕久久久久| 我要看黄色一级片免费的| 秋霞伦理黄片| 久久这里只有精品19| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲,欧美,日韩| 国产麻豆69| 中文字幕精品免费在线观看视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久视频综合| 久久久久国产精品人妻一区二区| 色网站视频免费| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩一本色道免费dvd| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品一区蜜桃| 超色免费av| 午夜福利视频精品| 久久久欧美国产精品| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品久久久久成人av| 两个人免费观看高清视频| 成人手机av| 热re99久久国产66热| 在线观看一区二区三区激情| 国产极品天堂在线| 一本大道久久a久久精品| 另类亚洲欧美激情| 美女国产视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产精品.久久久| 国产精品人妻久久久影院| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 久久精品国产综合久久久| 久久这里有精品视频免费| 国产熟女午夜一区二区三区| 一本久久精品| 久久久久精品人妻al黑| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 美女福利国产在线| 午夜免费观看性视频| 婷婷色综合大香蕉| 最近的中文字幕免费完整| 女性生殖器流出的白浆| 多毛熟女@视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 交换朋友夫妻互换小说| av卡一久久| 精品一品国产午夜福利视频| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久ye,这里只有精品| 亚洲伊人色综图| 久久久亚洲精品成人影院| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 777米奇影视久久| 韩国av在线不卡| 人体艺术视频欧美日本| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品一国产av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 女人久久www免费人成看片| 午夜激情久久久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 国产免费福利视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 人妻少妇偷人精品九色| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久精品久久精品一区二区三区| 考比视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人二区视频| 亚洲精品视频女| 9191精品国产免费久久| 久久久久国产网址| 色哟哟·www| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄色免费在线视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| www.av在线官网国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 自线自在国产av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91精品国产国语对白视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久精品久久久久真实原创| 另类精品久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 美女国产视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 极品人妻少妇av视频| www日本在线高清视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 久久 成人 亚洲| 亚洲国产看品久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 十分钟在线观看高清视频www| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲视频免费观看视频| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 天天影视国产精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 新久久久久国产一级毛片| av网站免费在线观看视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 自线自在国产av| 男女下面插进去视频免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久99一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人国语在线视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| kizo精华| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丰满少妇做爰视频| 两个人免费观看高清视频| av免费观看日本| 高清欧美精品videossex| 国产又色又爽无遮挡免| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜福利影视在线免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲男人天堂网一区| 女人精品久久久久毛片| a 毛片基地| 亚洲在久久综合| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久国内精品自在自线图片| 午夜福利一区二区在线看| 大香蕉久久成人网| 好男人视频免费观看在线| 一区福利在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品少妇久久久久久888优播| 免费看av在线观看网站| videosex国产| 多毛熟女@视频| 国产一级毛片在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 男女国产视频网站| 一级黄片播放器| 成年人免费黄色播放视频| 极品人妻少妇av视频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩精品有码人妻一区| 不卡av一区二区三区| 热99久久久久精品小说推荐| av福利片在线| 婷婷色综合www| 午夜免费男女啪啪视频观看| 成人黄色视频免费在线看| 性色avwww在线观看| 国产av一区二区精品久久| 99香蕉大伊视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品一二三| 在线观看三级黄色| 国产色婷婷99| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产日韩欧美亚洲二区| av片东京热男人的天堂| 丁香六月天网| 久久久久久伊人网av| 成年av动漫网址| 日本午夜av视频| 日韩一区二区三区影片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产又爽黄色视频| 欧美精品国产亚洲| 成年动漫av网址| 大码成人一级视频| 国产色婷婷99| 欧美中文综合在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美国产精品一级二级三级| 久久毛片免费看一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 夫妻午夜视频| kizo精华| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜免费男女啪啪视频观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人一区二区在线| 精品第一国产精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久狼人影院| 欧美国产精品一级二级三级| 国产又色又爽无遮挡免| av一本久久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成人影院久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人影院久久| 99re6热这里在线精品视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜福利,免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| av天堂久久9| 亚洲第一青青草原| 国产成人av激情在线播放| 伦精品一区二区三区| 国产综合精华液| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 99久久综合免费| 免费高清在线观看日韩| 国产精品久久久久成人av| 制服丝袜香蕉在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产xxxxx性猛交| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | av在线app专区| 亚洲综合色惰| 国产xxxxx性猛交| 日韩av免费高清视频| 午夜免费观看性视频| 精品一区在线观看国产| 亚洲久久久国产精品| xxxhd国产人妻xxx| 性高湖久久久久久久久免费观看| 好男人视频免费观看在线| 国产av码专区亚洲av| av电影中文网址| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人aa在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 性色av一级| 观看av在线不卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲av成人精品一二三区| 国产日韩欧美亚洲二区| 一边亲一边摸免费视频| 宅男免费午夜| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av免费高清在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 韩国av在线不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩av免费高清视频| 免费看不卡的av| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久网色| 大香蕉久久成人网| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲国产av新网站| 欧美97在线视频| 欧美国产精品一级二级三级| 日日撸夜夜添| 韩国精品一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产淫语在线视频| 制服人妻中文乱码| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费在线观看黄色视频的| 丁香六月天网| 一级毛片电影观看| 成年人免费黄色播放视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 永久网站在线| 国产精品免费视频内射| 欧美日韩精品成人综合77777| 日日啪夜夜爽| 欧美中文综合在线视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 嫩草影院入口| 精品福利永久在线观看| 超碰97精品在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 97在线视频观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 男女边吃奶边做爰视频| 成年人免费黄色播放视频| 性色avwww在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 免费看av在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产看品久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 婷婷色综合大香蕉| 天天影视国产精品| 久久综合国产亚洲精品| 99国产综合亚洲精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 两性夫妻黄色片| 自线自在国产av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 黄片小视频在线播放| 大片免费播放器 马上看| 成人毛片60女人毛片免费| 性色av一级| 亚洲伊人久久精品综合| 国产xxxxx性猛交| 久久综合国产亚洲精品| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品夜色国产| 少妇人妻 视频| 国产淫语在线视频| av在线播放精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产精品国产av在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产亚洲一区二区精品| 极品人妻少妇av视频| 午夜免费观看性视频| 国产av国产精品国产| 国产免费福利视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 各种免费的搞黄视频| 国产不卡av网站在线观看| 久久 成人 亚洲| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久热久热在线精品观看| 欧美精品国产亚洲| 国产一区二区三区综合在线观看| 91精品国产国语对白视频| 久久国产精品大桥未久av| 精品久久久精品久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 国产一区二区激情短视频 | 欧美成人午夜精品| 国产 一区精品| 老熟女久久久| 国产成人精品婷婷| 熟女av电影| 高清不卡的av网站| 国产有黄有色有爽视频| 五月天丁香电影| 欧美精品人与动牲交sv欧美| a 毛片基地| 午夜av观看不卡| www.自偷自拍.com| 精品午夜福利在线看| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 最近中文字幕2019免费版| a级毛片黄视频| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 国产国语露脸激情在线看| 91成人精品电影| 一边亲一边摸免费视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产免费视频播放在线视频| 大香蕉久久网| videossex国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久精品性色| 亚洲精品,欧美精品| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av男天堂| 在线观看人妻少妇| 色哟哟·www| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 午夜激情av网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久国产欧美日韩av| √禁漫天堂资源中文www| 1024香蕉在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久久久久久免| 搡女人真爽免费视频火全软件| 18禁动态无遮挡网站| av免费观看日本| 免费黄网站久久成人精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 午夜免费观看性视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 国产精品久久久久久av不卡| 99国产精品免费福利视频| 精品少妇内射三级| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 日日撸夜夜添| 日韩一区二区视频免费看| 精品第一国产精品| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人a∨麻豆精品| 久久国产精品大桥未久av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品自拍成人| 飞空精品影院首页| 性少妇av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 搡老乐熟女国产| 美女高潮到喷水免费观看| 一级毛片我不卡| 精品福利永久在线观看| 妹子高潮喷水视频| 性少妇av在线| 日韩一区二区视频免费看| 日韩成人av中文字幕在线观看|