低溫脅迫對(duì)木薯‘F200’幼苗葉片亞顯微結(jié)構(gòu)及其葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的影響

王馨 易拓 朱杰輝 宋勇

摘? 要：為探究低溫脅迫對(duì)木薯顯微結(jié)構(gòu)和光合效率的影響，對(duì)木薯耐寒品種‘F200和常栽低溫敏感型品種‘華南8號(hào)（‘SC8）在人工低溫條件下進(jìn)行4 ℃低溫處理，觀察處理前和處理3、6、12、24 h下幼苗葉片的掃描電鏡、透射電鏡及葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化情況，并比較兩品種間的差異。結(jié)果表明：（1）與‘SC8相比，隨著氣溫的降低‘F200的葉片氣孔會(huì)逐漸關(guān)閉且葉片蠟質(zhì)形成自我保護(hù)機(jī)制;（2）低溫脅迫狀態(tài)24 h后，‘F200葉肉細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器仍維持工作狀態(tài)，而‘SC8葉肉細(xì)胞基本死亡;（3）2個(gè)品種最大葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度下降且達(dá)到最大熒光所需時(shí)間均增加，‘F200的最大熒光值高于‘SC8;（4）低溫脅迫下，‘F200的各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)應(yīng)急反應(yīng)強(qiáng)度低于‘SC8，說(shuō)明‘F200對(duì)于在低溫逆境環(huán)境中生長(zhǎng)的能力強(qiáng)于‘SC8。

關(guān)鍵詞：木薯;低溫;顯微;葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類(lèi)號(hào)：S533????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Effect of Low Temperature Stress on Leaf Submicroscopic Structure and Chlorophyll Fluorescence Parameters of Cassava ‘F200 Seedlings

WANG Xin1， YI Tuo1， ZHU Jiehui1，5*， SONG Yong1，2，3，4*

1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. Potato Center of Hunan Province， Changsha， Hunan 410128， China; 3. Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding， Ministry of Education， Changsha， Hunan 410128， China; 4. Key Labortory for Vegetable Biology of Hunan Province， Changsha， Hunan 410128， China; 5. Orient Science &Technology College of Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China

Abstract： In order to investigate the effects of low temperature stress on the microstructure and photosynthetic efficiency of cassava， cold resistant cassava variety ‘F200 and low-temperature sensitive cassava variety ‘Huanan 8 （‘SC8） were treated at 4 ℃ under artificial low temperature condition. Scanning electron microscopy （SEM）， transmission electron microscopy （TEM） and chlorophyll fluorescence parameters were observed before and after 3 h， 6 h， 12 h and 24 h treatment， and the differences between the two varieties were compared. The results showed that： Compared with ‘SC8， with the decrease of air temperature， the stomata of ‘F200 leaves gradually closed and the wax in leaves formed a self-protection mechanism. After 24 h of low temperature stress， the organelles in ‘F200 mesophyll cells maintained functioning， while the mesophyll cells of ‘SC8 basically died. The maximum chlorophyll fluorescence intensity of the two cultivars decreased and the time required to reach the maximum fluorescence increased. The maximum fluorescence value of ‘F200 was higher than that of ‘SC8. Under low temperature stress， the emergency response intensity of various chlorophyll fluorescence parameters of ‘F200 was lower than that of ‘SC8， indicating that ‘F200 had a stronger ability to grow in low temperature adversity environment than ‘SC8.

Keywords： cassava; low temperature; microscopy; chlorophyll

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.015

木薯（Manihot esculenta Crantz）大戟科植物[1]，適宜生長(zhǎng)在平均溫度約為18 ℃以上且全年無(wú)霜期最低8個(gè)月的地區(qū)，當(dāng)氣溫低于15 ℃時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育逐漸受到抑制，溫度低于4 ℃便停止生長(zhǎng)[2-3]。中國(guó)完全適合木薯生長(zhǎng)的地區(qū)較少，為擴(kuò)大木薯的種植面積，保證我國(guó)的糧食安全，國(guó)家陸續(xù)多次出臺(tái)相關(guān)政策，例如：“木薯北移”戰(zhàn)略，將湖南等多省份作為適宜木薯種植的北移區(qū)域[4]。

不同環(huán)境下葉片相應(yīng)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不同的變化[5]。低溫的狀態(tài)下葉片中的細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)反應(yīng)尤為明顯[6]。氣孔作為植物與外界進(jìn)行氣體交換和水汽蒸騰的通道與葉片正常的功能運(yùn)轉(zhuǎn)有著密切的聯(lián)系[7]。葉綠素對(duì)低溫較敏感，其含量直接影響光合作用效率和光合產(chǎn)物的合成[8]。葉綠素?zé)晒庥兄鴱V泛的研究，作為光合作用研究的探針，可以用來(lái)檢測(cè)植物光合作用受環(huán)境的影響程度[9]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以靈敏地探測(cè)外界環(huán)境因子對(duì)植物光合作用造成的影響，在植物逆境研究方面顯示出較好的應(yīng)用前景[10]。快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線是一種快速獲得PSⅡ光化學(xué)活性、電子傳遞和光合器官結(jié)構(gòu)和狀態(tài)等信息的方法[11]。Strasser等[12]在生物膜能量流動(dòng)的基礎(chǔ)上，建立了針對(duì)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的數(shù)據(jù)分析和處理方法，并通過(guò)計(jì)算能量流和能量比率衡量在給定物理狀態(tài)下樣品內(nèi)部變化，建立了高度簡(jiǎn)化的能量流動(dòng)模型圖。這些能量包括ABS（吸收的光能）、TR（捕捉的光能）、ET（電子傳遞）、DI（熱耗散）[11，13]。

湖南等地的年平均氣溫較低，對(duì)木薯的正常生長(zhǎng)有或多或少的抑制，本研究在人工氣候室模擬湖南的溫度進(jìn)行試驗(yàn)，以木薯‘SC8為對(duì)照，研究木薯耐寒品種‘F200在低溫狀態(tài)下的葉片結(jié)構(gòu)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，旨在揭示木薯耐低溫機(jī)制在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試材料? 試驗(yàn)材料木薯品種‘F200以及對(duì)照材料木薯品種‘華南8號(hào)均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。

1.1.2? 材料處理? 試驗(yàn)時(shí)間為2019年7月，試驗(yàn)地點(diǎn)：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心人工氣候室，試驗(yàn)品種：‘F200和‘華南8號(hào)，截取15 cm左右長(zhǎng)度的木薯莖段，選取芽點(diǎn)完好且粗細(xì)和重量一致的莖段各70根，在直徑17 cm的育苗盆中基質(zhì)培養(yǎng)。放入FYS-1010W型室內(nèi)高照度人工氣候室中培養(yǎng)60 d（白天溫度/光強(qiáng)：28 ℃/7500 lx，晚上22 ℃/0 lx），當(dāng)木薯長(zhǎng)到7～8片葉片后，2個(gè)品種各取生長(zhǎng)勢(shì)一致的木薯30株進(jìn)行（4±1） ℃處理0、3、6、12、24 h，28 ℃為對(duì)照。葉綠素?zé)晒庠囼?yàn)葉片和取樣葉片均為從基部向上第三片成熟葉，進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡的試驗(yàn)。

1.2? 方法

掃描電鏡方法[14]觀察木薯葉片表面顯微結(jié)構(gòu)，透射電鏡方法[15]觀察木薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，葉綠素?zé)晒夥椒╗16]用Fluorpen便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定各處理的木薯苗功能葉片的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線（OJIP）和非光化學(xué)淬滅曲線（NPQ）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 常溫下木薯葉表面顯微結(jié)構(gòu)

‘F200和‘華南8號(hào)成熟葉片在結(jié)構(gòu)上有一定的差異，如圖1所示，2個(gè)品種木薯的下表皮氣孔分布為規(guī)則型，氣孔下陷形成氣孔窩，氣孔器均為長(zhǎng)橢圓形，表面蠟被和表茸毛十分豐富。如圖1A、圖1B所示，在相同面積、相同放大倍數(shù)的情況下，‘F200的木薯葉片氣孔密度比‘華南8號(hào)的大，且‘F200的氣孔周?chē)南灡缓腿~片表面的茸毛更豐富，如圖1C、圖1D所示。

2.2? 低溫脅迫下不同木薯葉片氣孔開(kāi)閉情況

王穎等[17]的研究表明，溫度對(duì)氣孔的開(kāi)放率有顯著影響，在其他條件相同的情況下，隨著溫度的降低，植物氣孔開(kāi)放也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。如圖2所示，放大5000倍，在常溫情況下，‘F200氣孔周?chē)懿贾鯛?、松針狀蠟質(zhì)，氣孔處于張開(kāi)狀態(tài)，低溫脅迫3 h，氣孔關(guān)閉，氣孔周?chē)南炠|(zhì)晶體熔融成片，覆蓋在氣孔口，這在一定程度上起到了阻隔低溫的作用，同時(shí)減少水分損失，低溫脅迫6、12、24 h，氣孔仍保持關(guān)閉狀態(tài)，氣孔周?chē)南炠|(zhì)由成片熔融狀變?yōu)樾?shù)枝狀再變?yōu)樗舍槧?。如圖3所示，放大5000倍，在常溫情況下，‘華南8號(hào)氣孔張開(kāi)，周?chē)炠|(zhì)呈絮狀，脅迫3、6、12、24 h、后，‘華南8號(hào)木薯氣孔依舊張開(kāi)，但隨著時(shí)間的增加，開(kāi)度逐漸減小，表面蠟質(zhì)由絮狀變?yōu)樾?shù)枝狀再熔融成片狀。

2.3? 常溫下木薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下木薯葉片細(xì)胞常溫超微結(jié)構(gòu)如圖4所示，常溫下，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，葉綠體緊貼細(xì)胞質(zhì)膜，呈梭型在細(xì)胞多處分布，葉綠體基粒片層垛疊清晰可見(jiàn)，呈平行排列，葉綠體內(nèi)有少量質(zhì)體小球和淀粉粒，線粒體在葉綠體周?chē)植?，?xì)胞核完整，核膜清晰可見(jiàn)，高爾基體的雙層膜清晰可見(jiàn)，在高爾基體旁有合成的蛋白質(zhì)顆粒，液泡占據(jù)細(xì)胞內(nèi)大部分空間，將細(xì)胞器擠向四周，液泡內(nèi)還有其他小顆粒物質(zhì)。

2.4? 低溫脅迫下木薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

如圖5，‘F200中A所示，低溫脅迫3 h后，‘F200木薯葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)清晰完整。葉綠體與原生質(zhì)膜出現(xiàn)小間隙，葉綠體的基粒片層較常溫下有些溶解，合成的淀粉粒增加，質(zhì)體小球數(shù)目也有所上升。開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞間隙，高爾基體和線粒體變得模糊，核膜不再清晰可見(jiàn)，液泡的界線不明顯。與‘F200相比（‘SC8圖A）處理3 h后，‘華南8號(hào)木薯葉片葉綠體中質(zhì)體小球數(shù)量和體積都超過(guò)‘F200，能夠看到清晰的液泡膜，同時(shí)細(xì)胞核膜有降解的現(xiàn)象。低溫脅迫6 h后，如圖‘F200B所示，細(xì)胞間隙繼續(xù)擴(kuò)大，有輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，葉綠體與原生質(zhì)體的間隙消失，葉綠體的基粒層垛疊結(jié)構(gòu)能較清晰的識(shí)別，葉綠體內(nèi)的質(zhì)體小球數(shù)目明顯減少，液泡內(nèi)蛋白質(zhì)、淀粉等滲透物質(zhì)增加。反觀‘華南8號(hào)（圖‘SC8 B），‘華南8號(hào)葉肉細(xì)胞間的間隙明顯增大，幾乎見(jiàn)不到葉綠體的基粒層，葉綠體內(nèi)的質(zhì)體小球數(shù)目幾乎占據(jù)了整個(gè)葉綠體，未見(jiàn)到較大體積的蛋白質(zhì)和淀粉顆粒，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較混沌，細(xì)胞核縮小。低溫脅迫12 h后，如圖‘F200C所示，細(xì)胞間的間隙繼續(xù)擴(kuò)大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞體積逐漸減小，葉綠體內(nèi)幾乎見(jiàn)不到基粒片層，葉綠體內(nèi)有一些質(zhì)體小球和較多明顯可見(jiàn)的淀粉顆粒，液泡內(nèi)蛋白質(zhì)等滲透物質(zhì)較多，細(xì)胞核縮小。處理12 h后，‘華南8號(hào)（圖‘SC8C）葉肉細(xì)胞間隙增大，質(zhì)壁分離現(xiàn)象較為明顯，葉綠體內(nèi)的基粒片層溶解，葉綠體內(nèi)合成淀粉顆粒，仍有較多的質(zhì)體小球存在于葉綠體內(nèi)，細(xì)胞核從內(nèi)至外開(kāi)始緩慢溶解。處理24 h后，如圖‘F200D所示，葉肉細(xì)胞之間有著明顯的間隙，葉綠體內(nèi)基本見(jiàn)不到基粒片層，同時(shí)，葉綠體內(nèi)的淀粉合成仍在繼續(xù)，質(zhì)體小球體積，數(shù)目增加，液泡內(nèi)的滲透物質(zhì)明顯增加，細(xì)胞體積繼續(xù)縮小。如圖‘SC8D所示，處理24 h后，‘華南8號(hào)葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁出現(xiàn)破損的傷口，細(xì)胞內(nèi)的葉綠體內(nèi)沒(méi)有合成淀粉，細(xì)胞液內(nèi)滲透物質(zhì)較少，找不出明顯的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞幾乎處于“死亡”狀態(tài)。

2.5? 低溫脅迫對(duì)木薯幼苗快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力曲線的影響

采用Fluorpen便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)量木薯葉片葉綠素?zé)晒饪焖僬T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線。如圖6所示，F(xiàn)K、FJ和FI分別是300 μs、1 ms和30 ms時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)m=FP即最大熒光強(qiáng)度。常溫情況下、‘F200（CK）和‘華南8號(hào)木薯葉片的OJIP曲線基本重合，4 ℃低溫脅迫下，OJIP曲線發(fā)生形變，2個(gè)品種最大葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度下降，‘F200的最大熒光高于‘華南8號(hào)，同達(dá)到最大熒光所需時(shí)間增加。

2.6? 低溫脅迫對(duì)木薯幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

采用Strasser等[18]的方法計(jì)算以下熒光參數(shù)。以有活性的反應(yīng)中心（RC）為基礎(chǔ)，在受到低溫等逆境脅迫時(shí)，單位有活性反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）、捕獲的光能（TRo/RC）和熱耗散的光能（DIo/RC）顯著增加，用于電子傳遞的能量（ETo/TRo）明顯減小，葉片通過(guò)減少電子傳遞所耗能量份額，增加熱耗散的能量份額以減少低溫等逆境引起的傷害。如表1所示，低溫脅迫下，‘華南8號(hào)木薯葉綠素?zé)晒鈪?shù)：ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC均顯著增加，ETo/TRo顯著減小;而‘F200木薯葉綠素?zé)晒鈪?shù)：ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC三者增加速度和幅度遠(yuǎn)小于‘華南8號(hào)，ETo/TRo減小程度小于‘華南8號(hào)。

低溫脅迫下，‘華南8號(hào)木薯葉片中電子傳遞到下游電子受體的概率φo、電子傳遞所需的量子產(chǎn)額φEo和PSⅠ受體側(cè)末端電子受體的量子產(chǎn)額φRo均隨著脅迫時(shí)間的增加大幅減小，熱耗散的量子比率φDo大幅度上升，這說(shuō)明低溫脅迫嚴(yán)重抑制了其電子傳遞，使得光反應(yīng)活性和PSⅠ的相對(duì)活性顯著下降。反觀‘F200木薯在低溫脅迫下對(duì)其φo、φEo、φRo三個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響程度弱，能夠較好地維持其正常的電子傳遞。

3? 討論

植物葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化能夠明顯且直觀的反映出植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)情況[19]。常溫情況下2個(gè)品種在結(jié)構(gòu)上有細(xì)微的差異：‘F200木薯幼苗蠟質(zhì)厚度更厚，氣孔數(shù)量也多于‘華南8號(hào)，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也反映出‘F200耐低溫的特征。低溫脅迫之后，‘F200氣孔迅速關(guān)閉，表面蠟質(zhì)晶體出現(xiàn)熔融現(xiàn)象將氣孔包裹住，這一特征與倪郁等[20]對(duì)低溫下擬南芥表皮蠟質(zhì)變化情況一致，而‘華南8號(hào)在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)反應(yīng)速度遠(yuǎn)小于‘F200，其受傷程度也更高。質(zhì)體小球在非生物或生物脅迫過(guò)程有參與適應(yīng)過(guò)程[21]。有研究表明，在遭受脅迫的情況下，大部分的質(zhì)體小球來(lái)源于類(lèi)囊體的溶解[22]。在本試驗(yàn)中，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，‘華南8號(hào)葉綠體內(nèi)質(zhì)體小球數(shù)量劇增且遠(yuǎn)大于‘F200葉綠體內(nèi)質(zhì)體小球數(shù)量，這表明‘F200植物特性可以緩解類(lèi)囊體的解體，維持葉綠體的正常功能。并且隨著脅迫時(shí)間的增加，‘F200淀粉粒合成數(shù)量明顯增多，主要用于緩解細(xì)胞失水，反作用于細(xì)胞的低溫耐性。在脅迫24 h后，‘F200細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍較為完整，能觀察到正在合成淀粉顆粒的線粒體，而‘華南8號(hào)木薯葉肉細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，2個(gè)品種木薯幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒(méi)有明顯差異，而在低溫脅迫下，2個(gè)品種木薯葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生變化，其中，ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC顯著增加且‘SC8增幅大于‘F200，ETo/TRo明顯減小且‘F200明顯小于‘SC8，這與彭晨等[23]的結(jié)果一致，說(shuō)明‘F200在緩解低溫脅迫對(duì)光和器官和功能上強(qiáng)于‘華南8號(hào)。同時(shí)，低溫脅迫導(dǎo)致與電子傳遞能力有關(guān)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)φo、φEo和φRo均下降，其中‘華南8號(hào)比‘F200下降幅度更大，有研究表明，其原因可能是低溫導(dǎo)致類(lèi)囊體膜的流動(dòng)性減小，從而導(dǎo)致類(lèi)囊體膜上的反應(yīng)中心、捕光天線、電子傳遞體等蛋白的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化[24]，這與本研究中透射電鏡圖中‘華南8號(hào)類(lèi)囊體的溶解情況基本一致。

綜上所述，本研究通過(guò)低溫下木薯葉片結(jié)構(gòu)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，從這2個(gè)角度闡釋了‘F200在低溫耐性的深層原理?！瓼200木薯氣孔周?chē)邆涓鼭饷艿慕q毛結(jié)構(gòu)、各細(xì)胞器在應(yīng)對(duì)低溫逆境有更強(qiáng)的抗壓能力、電子傳遞所耗能量份額較‘SC8小、熱耗散的能量份額較‘SC8大，具備耐低溫的潛力，對(duì)于打破種植區(qū)域溫度條件的限制有重大作用，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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