靈芝乙醇提取物上調(diào)Syk抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖、遷移和侵襲的研究

王海 徐幸幸 馬海 彭勇

胰腺癌是人類(lèi)最?lèi)盒缘膶?shí)體瘤之一，其特征在于診斷晚，進(jìn)展快，早期轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性。盡管近年來(lái)使用了越來(lái)越多的療法，包括手術(shù)切除，化學(xué)療法和放射療法，但患者總體5年生存率仍<5%[1,2]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的診斷和治療策略，并闡明相關(guān)的分子機(jī)制，以提高胰腺癌的診斷準(zhǔn)確性和臨床治療。靈芝系多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體，具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘的功效，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[3]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝乙醇提取物具有抑制胰腺癌、肺癌、宮頸癌等肝癌、胃癌、乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效果[4]。臨床資料表明，靈芝提取物對(duì)胰腺癌[5]的治療效果滿(mǎn)意，可以延長(zhǎng)生存期，提高患者生活質(zhì)量。但是，靈芝乙醇提取物對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的功能與分子機(jī)制仍不清楚，生物標(biāo)志物在腫瘤治療中的應(yīng)用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)此前被證明在胰腺癌中低表達(dá)，能夠抑制胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6,7]。但是Syk是否參與靈芝乙醇提取物影響胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程尚未可知?；诖耍狙芯靠疾觳煌瑵舛鹊撵`芝乙醇提取物對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并通過(guò)Syk基因探索其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 靈芝乙醇提取物(黃色粉末，含量為63.77 g/g生藥，成都榮保生物科技開(kāi)發(fā)有限公司)，胰腺癌細(xì)胞SW1990(美國(guó)典藏培養(yǎng)物保存中心)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，Lipofectamine 2000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，Syk過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Syk、過(guò)表達(dá)空載質(zhì)粒pcDNA3.1(上海GenePharma公司)，細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)小鼠單克隆抗體、上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)小鼠單克隆抗體、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)小鼠單克隆抗體及Syk小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞SW1990在RPMI 1640培養(yǎng)基中(10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素)培養(yǎng)，并在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SW1990分為以下幾組：對(duì)照組(未給予藥物)，低劑量藥物組(給予25 μg/ml靈芝乙醇提取物)，中劑量藥物組(給予50 μg/ml靈芝乙醇提取物)，高劑量藥物組(給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)，pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-Syk組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Syk)，高劑量藥物組+pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1并給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)，高劑量藥物組+pcDNA3.1-Syk組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Syk并給予100 μg/ml靈芝乙醇提取物)。其中，靈芝乙醇提取物作用時(shí)間為48 h。在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Lipofectamine 2000試劑將pcDNA3.1-Syk、pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到40%～50%匯合狀態(tài)的SW1990細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，使用不同濃度的靈芝乙醇提取物處理。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活 收集不同處理的細(xì)胞SW1990，按1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板。培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔20 μl，37℃孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μl，劇烈振蕩10 min以溶解結(jié)晶。之后于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的細(xì)胞吸光度(OD)值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 平板克隆測(cè)定細(xì)胞克隆形成 將不同處理的細(xì)胞SW1990接種到6孔板中，每孔5×102個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)2～3周。當(dāng)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞集落時(shí)，終止細(xì)胞培養(yǎng)，將SW1990細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，Giemsa染色10～30 min，并在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.6 Transwell小室法評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲測(cè)定：用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基將SW1990細(xì)胞調(diào)整至1×106個(gè)細(xì)胞/ml，取200 μl細(xì)胞置于Matrigel 預(yù)涂的Transwell上室中，并在下室添加600 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，將Transwell膜用4%多聚甲醛固定，用結(jié)晶紫染色10 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。在顯微鏡下觀察侵襲膜的細(xì)胞數(shù)目。遷移測(cè)定：Transwell上室不涂Matrigel，其余步驟相同。

1.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)分析Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達(dá) 將SW1990細(xì)胞在冷RIPA緩沖液中裂解，然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。之后，將PVDF膜在5%脫脂奶粉中一起于4℃孵育3 h。然后，將膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜，然后與二抗在37℃孵育1 h。使用ECL檢測(cè)免疫復(fù)合物。通過(guò)Image-Pro軟件分析相對(duì)蛋白表達(dá)，并將GAPDH用作內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，低、中、高劑量藥物組的細(xì)胞存活率明顯減少，克隆形成數(shù)顯著降低，二者均呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

2.2 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞遷移侵襲的影響 與對(duì)照組相比，低、中、高劑量藥物組細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，并呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞遷移侵襲的影響 個(gè),

2.3 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，低、中、高劑量藥物組SW1990細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯減弱，Syk蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，且均呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表3。

圖1 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk蛋白表達(dá)的影響

表3 靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達(dá)的影響

2.4 Syk對(duì)靈芝乙醇提取物作用的SW1990細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-Syk組、高劑量藥物+pcDNA3.1組、高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組的細(xì)胞存活率明顯減少，克隆形成率顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組SW1990細(xì)胞的細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于pcDNA3.1-Syk組或高劑量藥物+pcDNA3.1組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 Syk對(duì)靈芝乙醇提取物作用的SW1990細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響

2.5 Syk對(duì)靈芝乙醇提取物作用的SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達(dá)的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-Syk組、高劑量藥物組+pcDNA3.1組、高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯減弱，Syk蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與pcDNA3.1-Syk組或高劑量藥物+pcDNA3.1組相比，高劑量藥物+pcDNA3.1-Syk組SW1990細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯減弱，Syk蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

圖2 Syk對(duì)靈芝乙醇提取物作用的SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表5 Syk對(duì)靈芝乙醇提取物作用的SW1990細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表達(dá)的影響

3 討論

癌癥轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征之一，是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因。癌癥轉(zhuǎn)移包括許多相互依存的過(guò)程，如癌細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)，向周?chē)M織的侵襲，向身體遠(yuǎn)處的遷移以及其他器官的定植[8]。其中，腫瘤細(xì)胞遷移是轉(zhuǎn)移的先決條件，腫瘤細(xì)胞參與遷移和侵襲過(guò)程以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此，靶向腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性已在癌癥治療中引起了極大的關(guān)注[9]。靈芝是一種具有顯著[10]的抗腫瘤作用的中草藥，可以改善胰腺癌[5]和肝癌患者的生活質(zhì)量。在本項(xiàng)研究中，以胰腺癌細(xì)胞SW1990為研究對(duì)象，以評(píng)估靈芝乙醇提取物對(duì)胰腺癌的治療效果。結(jié)果表明，靈芝乙醇提取物可以有效抑制SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。值得注意的是，本研究揭示了Syk基因介導(dǎo)靈芝乙醇提取物抗胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，本研究提供了有關(guān)了解靈芝乙醇提取物治療腫瘤進(jìn)展效果的有用信息。

靈芝是一種藥用真菌，自古以來(lái)，它已被用于預(yù)防和治療各種疾病，例如慢性肝炎，腎炎，高血壓，支氣管炎和致瘤性疾病[11]。越來(lái)越多的研究報(bào)告稱(chēng)，靈芝可以顯著抑制多種癌癥的發(fā)生，侵襲和轉(zhuǎn)移，包括結(jié)腸癌[12]，肺癌[13]和白血病[14]，此外，靈芝可以保護(hù)肝臟，幾乎沒(méi)有毒性，并且可以減少化學(xué)療法對(duì)正常細(xì)胞的毒性[15]，這些使得靈芝成為抗癌的有希望的潛在治療和化學(xué)預(yù)防候選藥物。研究表明，靈芝提取物可以抑制乳腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力[8]，靈芝多糖可以減弱宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡并限制細(xì)胞周期，并且伴隨著E-cadherin表達(dá)的增加和N-cadherin表達(dá)的減少[16]。在本項(xiàng)研究中，結(jié)果顯示，25、50、100 μg/ml劑量的靈芝乙醇提取物可以抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的存活、克隆形成、遷移和侵襲能力，并降低Ki67和N-cadherin蛋白表達(dá)，提高E-cadherin蛋白表達(dá)，均呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，這表明靈芝乙醇提取物在胰腺癌中具有抗腫瘤活性，與前人報(bào)道[4,8,13]一致。

Syk是一種細(xì)胞質(zhì)非受體酪氨酸激酶，在多種造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)。在癌癥中，Syk與細(xì)胞遷移，淋巴血管浸潤(rùn)，微血管密度和/或轉(zhuǎn)移形成之間也存在相關(guān)性[17]。一些研究表明，Syk在癌癥中具有雙重作用，在白血病中，Syk是眾所周知的癌基因和腫瘤啟動(dòng)子[18]。相反，在乳腺癌中，它被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[19]。SyK的抑制可顯著降低卵巢腫瘤細(xì)胞的侵襲性[20]和阻止神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和菌落形成[21]。另一些資料顯示，Syk在乳腺癌和其他癌中的表達(dá)降低與存活率降低和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，Syk表達(dá)的增加增強(qiáng)了E-cadherin/catenin的磷酸化和穩(wěn)定化，從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲[22]。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，syk被確定為腫瘤分化/抑制因子的標(biāo)志，通過(guò)調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲作為腫瘤抑制劑[23]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了與乳腺癌[22]、胰腺導(dǎo)管腺癌[23]相同的結(jié)果，Syk過(guò)表達(dá)明顯減少胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率、克隆形成率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、Ki67、N-cadherin蛋白表達(dá)水平，顯著增加E-cadherin蛋白表達(dá)水平，為Syk作為胰腺癌腫瘤抑制因子提供了新的證據(jù)。

盡管靈芝及其提取物在腫瘤治療方面的益處已被廣泛報(bào)道，但其抗腫瘤的機(jī)制仍有待于闡明。Wang等[24]學(xué)者揭示了，程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)是靈芝介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的重要靶標(biāo)，靈芝可能通過(guò)減少PD-1蛋白和增強(qiáng)免疫反應(yīng)(例如T細(xì)胞浸潤(rùn))來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以抵抗疾病的發(fā)展，例如腫瘤的生長(zhǎng)。Wu等[25]首次報(bào)道了靈芝多糖可能促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程，該過(guò)程部分是通過(guò)非甾體類(lèi)抗炎藥激活基因-1(Non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1，NAG-1)誘導(dǎo)介導(dǎo)的。本研究進(jìn)一步評(píng)估靈芝乙醇提取物抗胰腺癌的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量的靈芝乙醇提取物以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)Syk的蛋白表達(dá)，提示Syk基因可能與靈芝乙醇提取物治療癌癥有關(guān)。另外，本研究還觀察到，Syk過(guò)表達(dá)后，靈芝乙醇提取物對(duì)SW1990細(xì)胞存活、克隆形成、遷移、侵襲、Ki67、N-cadherin蛋白表達(dá)的抑制作用被增強(qiáng)，且靈芝乙醇提取物對(duì)細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用也被增強(qiáng)。這些結(jié)果證實(shí)，上調(diào)Syk基因是靈芝乙醇提取物發(fā)揮胰腺癌抑制作用的重要途徑之一。

總之，本研究表明，靈芝乙醇提取物能夠以劑量依賴(lài)方式抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的增殖、遷移和侵襲，并且，Syk基因的上調(diào)可以增強(qiáng)靈芝乙醇提取物的這些功能。本研究確定了Syk為靈芝乙醇提取物抗胰腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)，這可能為靈芝作為胰腺癌和其他癌癥類(lèi)型的抗癌藥提供一種新思路。