天津市小麥田薺菜對(duì)雙氟磺草胺的抗性及其乙酰乳酸合成酶基因突變

李 琦, 于金萍, 郭文磊, 劉亦學(xué)*,, 張 惟

(1. 天津市植物保護(hù)研究所，天津 300381；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

薺菜Capsella bursa-pastoris是十字花科薺菜屬草本植物，在中國(guó)分布廣泛，其適應(yīng)性強(qiáng)、種子量大、競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，成熟后易傳播，可造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，是中國(guó)小麥種植區(qū)的主要惡性雜草之一[1-2]。近年來(lái)，隨著氣候及耕作制度的改變，薺菜已成為天津市冬小麥田主要優(yōu)勢(shì)雜草，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]。

乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS，EC 4.1.3.18) 在植物體內(nèi)主要催化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的第一階段，以ALS作為靶標(biāo)的除草劑可以通過(guò)抑制該酶的活性，使雜草無(wú)法合成上述3種氨基酸而死亡[4-6]。鑒于其低毒、高活性和高選擇性的特點(diǎn)，ALS抑制劑類(lèi)除草劑被長(zhǎng)期用于防除麥田雜草，但由于此類(lèi)除草劑作用位點(diǎn)單一，且長(zhǎng)期大面積單一使用，導(dǎo)致其抗性問(wèn)題十分嚴(yán)重[7]。截至2020年11月，全球已有165種雜草對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑產(chǎn)生了抗性[8]。

雜草對(duì)除草劑的抗性機(jī)理一般分為靶標(biāo)抗性(target site resistance) 和非靶標(biāo)抗性 (non-target site resistance)。靶標(biāo)抗性包括靶標(biāo)酶的過(guò)量表達(dá)及其基因突變；非靶標(biāo)抗性則包括雜草對(duì)除草劑解毒代謝能力的增強(qiáng)以及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的減少等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)雜草對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑產(chǎn)生抗性的主要原因是由于ALS基因保守區(qū)中的一個(gè)或幾個(gè)可變氨基酸被其他氨基酸替代所致，目前已經(jīng)報(bào)道證實(shí)有8個(gè)ALS基因氨基酸位點(diǎn)的27種氨基酸替代類(lèi)型與其抗性相關(guān)[10-11]。

雙氟磺草胺 (florasulam) 是美國(guó)陶氏農(nóng)業(yè)科學(xué)公司開(kāi)發(fā)的一種三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi) (triazolopyrimidines，TP) 除草劑，屬于ALS抑制劑類(lèi)，于2001年在我國(guó)正式獲準(zhǔn)登記，可防除小麥田大多數(shù)闊葉雜草。小麥?zhǔn)翘旖蚴兄匾募Z食作物之一，薺菜等闊葉雜草在天津市部分地區(qū)的小麥田發(fā)生危害較嚴(yán)重。近年來(lái)，天津市部分地區(qū)農(nóng)戶(hù)反映雙氟磺草胺對(duì)小麥田薺菜防治效果較差，推測(cè)薺菜可能對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生了抗性，但其具體抗性水平、抗性機(jī)制尚不明確。為此，本研究在天津市靜海區(qū)、武清區(qū)、寶坻區(qū)及薊州區(qū)等薺菜發(fā)生嚴(yán)重區(qū)域的冬小麥田采集部分薺菜種群，測(cè)定了其對(duì)雙氟磺草胺的敏感性，并擴(kuò)增、比對(duì)了敏感和抗性種群的ALS基因片段，以期為薺菜的有效防除及除草劑的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜草種子：于2018年6月，從天津市靜海區(qū)、武清區(qū)、寶坻區(qū)及薊州區(qū)等地冬小麥田采集薺菜Capsella bursa-pastoris種群共6個(gè)，分別編號(hào)為T(mén)J01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05和TJ06；另從天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院核心區(qū)內(nèi)未使用過(guò)任何除草劑的非耕地采集1個(gè)薺菜種群，作為敏感對(duì)照，編號(hào)TJ12。采集地點(diǎn)等具體信息見(jiàn)表1。

表1 供試薺菜種群采集點(diǎn)信息Table 1 Location of C. bursa-pastoris populations collected

供試除草劑：50 g/L雙氟磺草胺 (florasulam)懸浮劑 (SC)，天津市華宇農(nóng)藥有限公司。

生物試材：植物基因組DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司?；驍U(kuò)增引物由金唯智 (天津) 生物科技有限公司合成。

主要儀器：ASS-4型自動(dòng)控制噴灑系統(tǒng)，北京盛恒天寶科技有限公司；5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；T100型PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HDL潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RXZ-280C植物培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；GZX型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薺菜對(duì)雙氟磺草胺的抗性水平測(cè)定 采用整株水平測(cè)定法[12]。從各薺菜種群中選取籽粒飽滿(mǎn)均勻一致的種子，置于含2層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿加5 mL滅菌水保濕，將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中催芽 (光周期：12 h/12 h；溫度：20 ℃/15 ℃)。將15粒露白的薺菜種子均勻播種于直徑12 cm的塑料盆內(nèi)，置于可控溫室中培養(yǎng) (自然光照，溫度20～35 ℃，相對(duì)濕度50%～70%)。待生長(zhǎng)至2片真葉時(shí)間苗，每盆留長(zhǎng)勢(shì)基本一致的薺菜10株。

待長(zhǎng)至3～4葉期，用ASS-4型自動(dòng)控制噴灑系統(tǒng)進(jìn)行莖葉噴霧。噴霧壓力為0.275 MPa，噴液量450 L/hm2。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)定雙氟磺草胺的處理劑量 (有效成分用量) 分別為：抗性種群 (R)，0、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5、187.5 g/hm2；敏感種群 (S)，0、0.012、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5 g/hm2。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)共重復(fù)2次。噴藥后21 d，剪取薺菜地上部分，于恒溫干燥箱內(nèi)75 ℃下烘干72 h，稱(chēng)量干重并記錄。

1.2.2 薺菜ALS基因片段克隆 從薺菜抗性和敏感種群中分別隨機(jī)選取20株進(jìn)行基因組DNA提取。待薺菜生長(zhǎng)至4葉期后，剪取單株幼嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用已報(bào)道的兩對(duì)引物序列[13]：Forward 1(5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′)/Reverse 1 (5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′) 和Forward 2 (5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′)/Reverse 2 (5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′)，用于薺菜ALS基因擴(kuò)增，其擴(kuò)增片段包含已報(bào)道與抗性相關(guān)的8個(gè)基因突變位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括：1 μL基因組DNA模板，1 μL正向引物 (10 μmol/L)，1 μL反向引物 (10 μmol/L)，10 ×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，9.5 μL無(wú)核酸酶水。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，將含目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金唯智 (天津) 生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得序列在NCBI上與薺菜ALS基因進(jìn)行BLAST比對(duì)，用DNAMAN 6.0.3軟件對(duì)擴(kuò)增所得敏感、抗性種群薺菜ALS基因進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙邏輯非線(xiàn)性回歸模型y=C+ {(D–C)/[1 + (x/GR50)b]} 擬合劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，計(jì)算出抑制50%薺菜生長(zhǎng)所需的除草劑劑量 (GR50值)。式中：y為除草劑某一劑量下薺菜干重相對(duì)于空白對(duì)照的百分比；x為除草劑劑量；C為劑量反應(yīng)下限；D為劑量反應(yīng)上限；b為斜率。

抗性倍數(shù) (resistance index，RI) 計(jì)算公式為：RI = GR50(TJ01-TJ06)/ GR50(TJ12)。式中，GR50(TJ01-TJ06)為抗性種群的GR50值，GR50(TJ12)為敏感種群的GR50值。參考Beckie等[14]的方法對(duì)抗性情況進(jìn)行分級(jí)：RI < 2為敏感，2 ≤ RI < 5為低水平抗性，5 ≤RI ≤ 10為中等水平抗性，RI > 10為高水平抗性。

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件的ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用SigmaPlot 12.5軟件繪制劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同薺菜種群對(duì)雙氟磺草胺的抗性水平

整株水平測(cè)定結(jié)果 (表2) 表明，所采集的6個(gè)薺菜種群對(duì)雙氟磺草胺都產(chǎn)生了高水平抗性，GR50值在5.7～23.6 g/hm2之間，與敏感種群TJ12相比，6個(gè)田間種群的抗性倍數(shù)在11.4～47.2之間。

表2 不同薺菜種群對(duì)雙氟磺草胺的抗性水平Table 2 Resistance ratio of C. bursa-pastoris to florasulam

2.2 薺菜抗性和敏感種群ALS基因差異

以提取的薺菜敏感和抗性種群?jiǎn)沃昊蚪MDNA為模板對(duì)ALS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的兩條ALS基因序列拼接后長(zhǎng)度為1 738 bp，與NCBI中薺菜ALS基因序列 (HQ880660.1) 的同源性達(dá)99%以上。擴(kuò)增的ALS基因片段包含了所有已報(bào)道的ALS基因抗性突變位點(diǎn)。將抗性和敏感種群的ALS基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：在產(chǎn)生抗性的6個(gè)薺菜種群中，所有單株的ALS氨基酸序列的第197位氨基酸密碼子均由CCT突變?yōu)榱薚CT，從而導(dǎo)致脯氨酸 (Pro) 突變?yōu)榻z氨酸(Ser) (表3)。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)抗性種群中隨機(jī)選取的120個(gè)單株所發(fā)生的突變都是雜合型突變 (即197位密碼子為CCT/TCT)。

表3 薺菜抗性與敏感種群ALS基因序列比對(duì)分析Table 3 Sequence alignment and deduced amino acid of the resistant and susceptible C. bursa-pastoris populations

3 結(jié)論與討論

通過(guò)整株水平測(cè)定發(fā)現(xiàn)，采自天津市冬小麥田的6個(gè)薺菜種群TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05、TJ06均對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生了高水平抗性，其抗性倍數(shù)在11.4～47.2之間。連續(xù)重復(fù)使用單一作用機(jī)制的除草劑是導(dǎo)致雜草抗藥性產(chǎn)生的重要原因[15]。據(jù)報(bào)道，ALS抑制劑類(lèi)除草劑連續(xù)重復(fù)使用3～5年以上，就可導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗性[16]。本研究中，抗性種群采集地塊皆有多年使用雙氟磺草胺防治闊葉雜草的歷史。此外，隨意提高施藥劑量、同一生產(chǎn)季度內(nèi)多次施用具有相同作用機(jī)制的除草劑等不合理的施藥方式也加劇了雜草抗藥性的發(fā)生和傳播[17]。據(jù)張樂(lè)樂(lè)[18]報(bào)道，薺菜種子位于土壤表層時(shí)最適宜萌發(fā)，隨著埋藏深度增加其萌發(fā)率顯著降低，當(dāng)超過(guò)1.2 cm時(shí)，萌發(fā)將完全被抑制。因此，在小麥種植前對(duì)土壤進(jìn)行適度深耕，可有效降低薺菜的危害。此外，合理選擇不同作用機(jī)制的除草劑交替和混合使用也可以延緩雜草抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。

靶標(biāo)酶基因突變是雜草對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。本研究中，產(chǎn)生抗性的6個(gè)薺菜種群植株的ALS基因都發(fā)生了Pro-197-Ser突變，已有報(bào)道表明，多種雜草因該突變產(chǎn)生了對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑的抗性[14]，因此，Pro-197-Ser突變很可能是本研究中薺菜抗性種群對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性的重要原因。Yu等[19]通過(guò)對(duì)ALS酶動(dòng)力學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)Pro-197-Ser突變對(duì)ALS功能幾乎沒(méi)有影響，不會(huì)影響薺菜的正常生理過(guò)程，因此這可能是該突變形式在天津廣泛存在的原因之一。張樂(lè)樂(lè)[18]報(bào)道，薺菜的ALS基因中含有2個(gè)拷貝，并且這2個(gè)拷貝均可發(fā)生抗性基因突變，這可能是導(dǎo)致目前天津發(fā)現(xiàn)的抗性種群突變都是雜合型突變的關(guān)鍵因素。

長(zhǎng)期在同一區(qū)域使用相同類(lèi)型的除草劑，對(duì)雜草產(chǎn)生高選擇壓，會(huì)加速其抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，而盲目用藥又會(huì)進(jìn)一步加劇抗藥性的蔓延。本研究?jī)H從整株水平測(cè)定和靶標(biāo)基因突變分析的角度進(jìn)行了研究，下一步還需針對(duì)有關(guān)靶標(biāo)酶活性的測(cè)定、交互抗性、代謝酶等與抗性關(guān)聯(lián)的其他問(wèn)題進(jìn)行深入地研究剖析。