烏梅丸及其拆方對TNBS致潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用研究?

郭 琴， 張立石， 王 穎， 王歡歡， 柏 冬△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種常見的病因不明、反復(fù)發(fā)作的消化系統(tǒng)疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、體質(zhì)量減輕、黏液膿血便等癥狀。隨著全球經(jīng)濟的發(fā)展，UC逐漸從歐美發(fā)達國家地區(qū)蔓延至亞洲、南美和中東等新興工業(yè)化國家地區(qū)[1]，成為全球性疾病，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。

UC病變部位主要在結(jié)腸黏膜和黏膜下層，以局部潰瘍病變?yōu)橹鳎页蔬B續(xù)彌漫性分布[2]，表現(xiàn)為水腫、黏膜破壞、大量炎性細(xì)胞浸潤和大面積出血等[3]，炎性反應(yīng)和免疫是UC最大的病理特征，而白介素(interleukin，IL)-1β[4]和環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)-2[5]均是與UC關(guān)系密切的重要細(xì)胞因子。因此本文測定了UC大鼠給藥后的結(jié)腸質(zhì)量長度比、IL-1β及COX-2的水平，從形態(tài)和生理兩方面觀察烏梅丸及其各拆方組對UC大鼠的作用。

據(jù)報道，烏梅丸對UC具有確切療效[6-8]，該方出自張仲景的《傷寒雜病論》，主要用于治療蛔厥和久利[9]。藥物組成：烏梅30 g，細(xì)辛3 g，干姜9 g，黃連6 g，當(dāng)歸6 g，附子6 g，花椒5 g，桂枝6 g，人參6 g和黃柏6 g，根據(jù)中醫(yī)藥味理論可將其分為酸、苦、甘、辛4種[10]。因此，本文以2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的UC大鼠為藥效模型，以烏梅丸的4個藥味為實驗因素，采用L8(27)正交表設(shè)計實驗，觀察烏梅丸及其各拆方組對UC大鼠的影響，分析探討4種藥味在治療UC過程中的作用和相互關(guān)系。本研究已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物倫理委員會審批，批號JCS2018012。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SPF級SD大鼠，鼠齡2個月，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度和濕度分別為24 ℃和28%，大鼠5只/籠，用混合配方飼料(由北京科澳協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)，自由進食飲水，每日更換飲水，保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生，在無菌條件下和12 h/12 h光照/黑暗周期下飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

烏梅(Prunusmume，171215)、細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq.，180506)、干姜(Zingiberoj-jicinaleRosc.，180119)、黃連(CoptischinensisFranch.，171123)、當(dāng)歸(Angelicasinensis，180603)、附子(AconitumcarmichaeliDebx.，180512)、花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.，180117)、桂枝(CinnamomumcassiaPresl，171229)、人參(Ginsengradixetrhizoma，180228)和黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.，180507)藥材均購自北京同仁堂藥店，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為正品。TNBS(P2297，美國Sigma公司)；COX-2 Elisa試劑盒(SEA699Ra)購自美國USCN life science公司；IL-1β Elisa 試劑盒(RTA00)購自美國R&D systems公司。

1.3 儀器

AR2130型分析天平(美國OHAUS公司)；3K15型高速低溫離心機(美國Sigma公司)；Pro200型電動勻漿器(美國PRO Scientific Inc公司)；Elx800型酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Elx50/8型洗板機(美國BioTek公司)；WELVAC210型96孔板真空抽濾裝置(美國PALL公司)；MABVN0B型96孔真空過濾板(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 藥物的制備

將烏梅丸拆成4組，分別是A組酸味藥(烏梅30 g)；B組苦味藥(黃連6 g、黃柏6 g)；C組甘味藥(人參6 g、當(dāng)歸6 g)；D組辛味藥(桂枝6 g、細(xì)辛3 g、花椒5 g、附子6 g、干姜9 g)，以含有該組藥味和不含該組藥味為1、2水平，采用L8(27)正交實驗安排實驗藥物分組，如下表1所示。

表1 烏梅丸拆方的正交實驗設(shè)計

按正交表設(shè)計的7個樣品處方劑量稱取藥材，加8倍水煎煮1 h，第2次6倍量水煎煮1 h合并濾液，水浴濃縮至稠膏，70 ℃減壓真空干燥6 h，得干浸膏粉，稱質(zhì)量、粉碎過篩。各樣品膏質(zhì)量如下：1號方(23.87 g/劑)，2號方(12.59 g/劑)，3號方(17.34 g/劑)，4號方(14.64 g/劑)，5號方(8.18 g/劑)，6號方(6.90 g/劑)，7號方(11.09 g/劑)。

2.2 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備

所有大鼠實驗前禁食不禁水24 h，實驗開始大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，按5% TNBS 0.6 mL加0.25 mL的無水乙醇比例配制TNBS乙醇灌腸液，取仰臥位，將1根聚乙烯管(直徑約2 mm)經(jīng)肛門插入腸道，深度8 cm, 將0.3 mL的TNBS乙醇灌腸液注入腸道，保持肛門高30 s，30 min后，有大量糞便排出，再按上述方法經(jīng)肛門注入TNBS乙醇灌腸液0.85 mL，保持肛門高位5 min以防止液體流出，正常組大鼠以等量生理鹽水取代TNBS灌腸液灌腸, 其余過程均相同[11]。

2.3 分組與給藥

在TNBS乙醇液灌腸后的第2天，選擇有明顯腹瀉指征(肛門有稀溏大便或有膿血)的大鼠進入實驗，未腹瀉的大鼠棄去不用。按隨機數(shù)字表法對腹瀉大鼠分為模型組、1號方組、2號方組、3號方組、4號方組、5號方組、6號方組、7號方組，同時設(shè)經(jīng)9%氫化鈉溶液灌腸大鼠作為正常組，每組各15只。

在分組的當(dāng)天進行藥物干預(yù)，模型組和正常組灌服生理鹽水，各烏梅丸拆方組灌服2倍臨床劑量藥液，1～6號方組分別灌服1～6號方浸膏，劑量依次是4.30 g/kg、2.27 g/kg、3.12 g/kg、2.63 g/kg、1.47 g/kg、1.24 g/kg、2.00 g/kg，灌胃治療14 d。

2.4 取材

動物于藥物干預(yù)的第14天開始禁食不禁水24 h，用1%戊巴比妥鈉60 mg/kg對大鼠進行深度麻醉，稱重后剖開腹腔，截取自結(jié)腸脾曲向下約2 cm結(jié)腸，剝離腸管外血管和脂肪組織，量取長度并稱重，結(jié)束后迅速用鋁箔包裹，液氮速凍-80 ℃保存。

2.5 細(xì)胞因子IL-1β和COX-2水平檢測

用液氮研缽將凍存的腸組織標(biāo)本研碎，將腸組織粉末移至1.5 mL離心管中稱重，加入10倍體積的PBS溶液進行勻漿并取上清液，參照ELISA試劑盒說明書所用方法測定腸組織中IL-1β和COX-2的水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 烏梅丸不同拆方對UC大鼠的影響

各組大鼠取材后，對結(jié)腸測得的質(zhì)量長度比、IL-1β和COX-2的含量按均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進行統(tǒng)計，表2為烏梅丸及其拆方組對UC大鼠的影響。對表2進行Dunnet-t檢驗發(fā)現(xiàn)，模型組與正常組之間除體質(zhì)量外的3個指標(biāo)均有明顯差異(P<0.05)，因此對質(zhì)量長度比、IL-1β和COX-2水平進行方差分析。

表2 烏梅丸各拆方組對UC大鼠的影響

3.2 烏梅丸不同拆方對結(jié)腸質(zhì)量長度比的正交結(jié)果與方差分析

表3示，模型組與正常組之間的結(jié)腸質(zhì)量長度比有明顯差異(P<0.05)。從方差結(jié)果可見，酸、辛、甘因素對結(jié)腸質(zhì)量長度比有顯著影響(P<0.05)，影響因素主次順序為A(酸)>D(辛)>C(甘)>B(苦)，最佳組合為A1、B2、C1、D1(酸+甘+辛)。表4示，利用Dunnett-t檢驗將各拆方組與模型組比較，由統(tǒng)計結(jié)果可得，拆方1(全方)、3(酸+甘)、7(甘+辛)組與模型組有顯著差異(P<0.05)，繼續(xù)使用LSD比較，3個拆方組之間無顯著差異。

表3 烏梅丸各拆方組對結(jié)腸質(zhì)量長度比的方差分析

表4 烏梅丸各拆方組與模型組關(guān)于結(jié)腸質(zhì)量長度比差異性比較

3.3 烏梅丸不同拆方對IL-1β水平的正交結(jié)果和方差分析

表5示，烏梅丸拆方的各因素對IL-1β水平的正交結(jié)果和方差分析結(jié)果可見，各因素對IL-1β水平的影響主次是B(苦)>A(酸)>D(辛)>C(甘)，但苦因素對該指標(biāo)有顯著性負(fù)影響(P<0.05)，為負(fù)相關(guān)，最佳組合為A1、B2、C1、D1(酸+甘+辛)。表6示，烏梅丸不同拆方組與模型組關(guān)于IL-1β水平的差異性比較結(jié)果可得，各拆方組對模型均無顯著性改善，較其他組而言，拆方3(酸+甘)和7(甘+辛)改善相對較好。

表5 烏梅丸各拆方組對IL-1β水平的方差分析

表6 烏梅丸各拆方組與模型組關(guān)于IL-1β水平的差異性比較

3.4 烏梅丸不同拆方對COX-2水平的正交結(jié)果和方差分析

表7示，烏梅丸拆方的各因素對COX-2水平的正交結(jié)果和方差分析可見，酸和甘因素對COX-2水平有顯著影響(P<0.05)，各因素對COX-2水平的影響主次是A(酸)>C(甘)>B(苦)>D(辛)，最佳組合為A1、B2、C1、D1(酸+甘+辛)。表8示，烏梅丸不同拆方組與模型組關(guān)于COX-2水平的差異性比較結(jié)果可得，拆方3組(酸+甘)與模型組有顯著差別(P<0.01)。

表7 烏梅丸各拆方組對COX-2水平方差分析

表8 烏梅丸各拆方組與模型組關(guān)于COX-2水平差異性比較

4 討論

UC屬于中醫(yī)學(xué)“腸癖”“瀉下”“久痢”“下痢”等范疇[12]，本虛標(biāo)實，外感濕熱、飲食不節(jié)、情志不暢或稟賦不足是其基本病因[13]。UC病程中，邪氣熾盛，病邪中以濕、熱、毒為主，濕熱尤其傷脾[14]。UC患者大多生活壓力大，暴躁易怒而致肝氣不暢，且在邪正交爭的過程中體內(nèi)濕熱與氣血相搏，情志又與氣血運行相互影響。因此，濕熱內(nèi)蘊、肝脾不和、氣血失調(diào)、情志不暢是UC的常見病機。

關(guān)于烏梅丸治療UC的拆方研究，谷松課題組認(rèn)為，烏梅丸主要以辛開苦降、寒溫并施的配伍方式治療UC，因此將烏梅丸拆分成辛開苦降組、辛開組、苦降組和補益組，以TNBS/乙醇法制備大鼠UC模型。采用ELISA法測量脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的分解產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)發(fā)現(xiàn)，烏梅丸組及辛開苦降組對大鼠結(jié)腸黏膜組織SOD和MDA水平的改善效果均比辛開組、苦降組和補益組好，說明烏梅丸可通過減輕結(jié)腸黏膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)治療潰瘍性結(jié)腸炎[15]；采用ELISA法檢測結(jié)腸黏膜組織抑炎因子IL-10與促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF)-α水平發(fā)現(xiàn)，烏梅丸組及辛開苦降組可顯著升高IL-10水平，降低TNF-α水平，其他拆方組雖對IL-10和TNF-α水平有所調(diào)節(jié)，但效果不如烏梅丸組和辛開苦降組[16]；采用RT-PCR法檢測結(jié)腸黏膜組織IL-6、非受體酪氨酸激酶(janus kinase, JAK)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT3)mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，烏梅丸組和辛開苦降組均能顯著降低IL-6 /JAK/STAT3信號通路中3個指標(biāo)的基因表達，且效果優(yōu)于辛開組、苦降組和補益組[17]；采用ELISA法檢測結(jié)腸黏膜IL-4、誘導(dǎo)吲哚胺(Interferon, INF)-γ水平，免疫組化法觀察Toll樣受體9(Toll-like receptors9，TLR9)、髓樣分化因子88(myeloid d ifferentiation factor88，My D88)、細(xì)胞核因子κBp65(nuclear factor kappa-Bp65，NF-κBp65)的表達，結(jié)果顯示烏梅丸組、辛開苦降組均能顯著升高IL-4水平，降低INF-γ水平，減少結(jié)腸黏膜TLR9、My D88、NF-κBp65的蛋白表達，且效果優(yōu)于其他拆方組[18]。因此，該課題組通過檢測與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、炎性反應(yīng)及通路有關(guān)的細(xì)胞因子和蛋白發(fā)現(xiàn)，烏梅丸組和辛開苦降組對于UC的治療效果優(yōu)于其他拆方組。周永學(xué)課題組認(rèn)為，UC臨床常表現(xiàn)為寒熱錯雜、虛實夾雜，因此根據(jù)寒熱藥性及治法將烏梅丸拆為溫?zé)峤M、苦寒組、補益組、收斂組和寒熱并用組，以TNBS/乙醇灌腸建立大鼠UC模型，檢測大鼠結(jié)腸組織IL-1、IL-10、TNF-α、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的含量變化，發(fā)現(xiàn)烏梅丸溫?zé)峤M在升高IL-10和降低PGE2水平方面作用突出，寒涼組藥物在降低IL-1、TNF-α、MPO含量、對抗體溫升高方面作用突出[19]；RT-PCR法檢測各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、MYD88和NF-κBmRNA的表達，結(jié)果顯示寒涼組和溫?zé)峤M藥物均可以通過MYD88依賴途徑抑制TLR4/NF-κB信號通路的傳導(dǎo), 但烏梅丸組和寒熱并用組的效果更好[20]，說明烏梅丸通過寒熱配伍具有協(xié)同和增效作用。

本研究結(jié)果顯示，UC模型組與正常組大鼠之間的結(jié)腸質(zhì)量長度比、IL-1β和COX-2水平具有顯著差異。酸、辛和甘味藥物對大鼠結(jié)腸質(zhì)量長度比有顯著影響(酸>辛>甘)，全方組、酸+甘組和甘+辛組可顯著降低UC大鼠結(jié)腸質(zhì)量長度比。研究發(fā)現(xiàn)，UC患者IL-1β水平明顯高于正常人[21]，IL-1β作為一種促炎因子，該因子的異常分泌會引起一系列的炎性反應(yīng)介質(zhì)釋放，并誘導(dǎo)和加重結(jié)腸黏膜局部的炎性反應(yīng)[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，苦味藥物對IL-1β含量具有顯著負(fù)影響，酸+甘組、甘+辛組對UC大鼠結(jié)腸組織的IL-1β有調(diào)節(jié)作用。COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，其表達常伴隨著炎性反應(yīng)發(fā)生后結(jié)腸固有層各種炎性細(xì)胞因子的增多而增加[23]。本研究結(jié)果顯示，酸和甘味藥物對COX-2含量具有顯著影響(酸>甘)，7個拆方組中酸+甘藥物組合對COX-2含量有顯著調(diào)節(jié)作用。

綜合以上分析，酸味藥物(烏梅)對大鼠UC模型具有重要的調(diào)節(jié)作用，體現(xiàn)了其作為方中君藥的作用，其次為甘、辛，而苦味藥材對大鼠UC模型具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。酸、甘和辛味藥物的組成對結(jié)腸質(zhì)量長度比、IL-1β、COX-2水平有顯著調(diào)節(jié)作用，說明酸、甘和辛味藥物在方劑中起主導(dǎo)作用，苦味藥物也對藥物的配伍有重要意義?？辔端幬飳Υ笫骍C模型具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，本文分析其原因在于TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的證候?qū)傩钥赡転殛柼撟C，是否如此有待進一步的研究。