分子標(biāo)記技術(shù)在玉米種子純度鑒定中的應(yīng)用

李 晶，王雅琳，尹祥佳

（蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 甘肅，蘭州 730070）

玉米是我國重要的糧食作物，也是發(fā)展工業(yè)和畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼料原料，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中處于非常重要的地位。玉米增產(chǎn)對糧食增產(chǎn)的貢獻(xiàn)率近60%，居糧食作物之首[1]，我國2019年玉米播種面積達(dá)4128萬公頃，總產(chǎn)量達(dá)到2.6億噸。當(dāng)前，我國處于實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的關(guān)鍵時(shí)期，提高糧食綜合生產(chǎn)能力，保障農(nóng)民種糧收益是促進(jìn)農(nóng)業(yè)技術(shù)發(fā)展，推動產(chǎn)業(yè)興旺的重要途徑，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會等現(xiàn)實(shí)意義[2]。作為我國第一大作物的玉米在這個(gè)發(fā)展進(jìn)程中將發(fā)揮舉足輕重的作用。

玉米是市場化程度最高的作物，玉米雜交種優(yōu)勢的利用有力的提高了我國玉米產(chǎn)量，但是也面臨著一些問題，隨著玉米雜交種商業(yè)化程度越來越高，種業(yè)企業(yè)的玉米種子生產(chǎn)質(zhì)量成為了不容忽視的問題，而相關(guān)市場上出現(xiàn)了大量不合格的玉米種子，導(dǎo)致了玉米種植戶減產(chǎn)，極大地?fù)p害了農(nóng)戶的利益，所以種子純度鑒定越來越受到關(guān)注。種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是影響玉米種植產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，玉米種子純度不合格率每增加1%，將造成每公頃減產(chǎn)損失214kg左右，減產(chǎn)率約為3%[3]。影響玉米雜交種純度的主要因素有機(jī)械和生物學(xué)混雜，其中母本去雄不徹底、不及時(shí)是影響種子純度的主要原因[4]。甘肅省是我國玉米雜交種生產(chǎn)的主產(chǎn)區(qū)，其中河西地區(qū)是我國重要的國家級玉米制種基地，常年制種面積穩(wěn)定在10～13.3萬公頃[5]。目前，甘肅省內(nèi)推廣的玉米品種數(shù)量近200個(gè)，因此快速、準(zhǔn)確地檢測玉米種子純度是保障甘肅玉米種植業(yè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也能為落實(shí)“技能甘肅”，服務(wù)甘肅省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略提供技術(shù)支撐。

種子純度鑒定方法有田間鑒定法、生化標(biāo)記法和DNA分子標(biāo)記法等。田間鑒定法是傳統(tǒng)的鑒定方法，比較直觀，但鑒定周期長，成本高，同時(shí)受季節(jié)、栽培措施及環(huán)境的影響。生化標(biāo)記法則是利用同工酶、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)對不同品種蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定過程經(jīng)濟(jì)、方便、簡單，但結(jié)果易受發(fā)育期，取樣部位和環(huán)境條件的影響，也很難區(qū)分親緣關(guān)系比較近的雜交種。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，使種子純度鑒定進(jìn)入了DNA水平，因其具有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，為作物品種純度分析提供了更為準(zhǔn)確、可靠、方便、快速的方法，所以被廣泛應(yīng)用于玉米自交系和雜交種純度鑒定。因此，本文對RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SNP五種分子標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種純度鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行對比分析，為玉米種子純度鑒定研究工作提供參考。

1 分子標(biāo)記技術(shù)的原理和特點(diǎn)

分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，是從DNA水平上進(jìn)行多態(tài)性分析，從而反映基因型的差異。目前，分子標(biāo)記技術(shù)主要用于玉米的遺傳多樣性分析，劃分雜種優(yōu)勢群，主要性狀的QTL定位，關(guān)聯(lián)分析，指紋圖譜構(gòu)建，種子純度鑒定等方面[6]。DNA分子標(biāo)記鑒定玉米種子純度是直接以種子的DNA片段作為研究對象，揭示子代與親本間的遺傳差異，彌補(bǔ)和克服了種子純度的傳統(tǒng)鑒定方法中的不足，具有以下顯著優(yōu)勢：一是在玉米生長階段均可檢測，不受環(huán)境因素影響；二是能夠檢測微小的變異，操作簡便，獲得鑒定結(jié)果較快，數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠；三是DNA分子標(biāo)記的數(shù)量多，遍及整個(gè)玉米10條染色體；四是多數(shù)標(biāo)記共顯性，能夠鑒別出純合體與雜合體基因型；五是分離出的樣品DNA保存時(shí)間長，有助于進(jìn)行追溯或仲裁[7]。目前，應(yīng)用于玉米種子純度研究的DNA分子標(biāo)記主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單序列重復(fù)（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中，SNP作為第三代分子標(biāo)記，因可精確到基因組中的單堿基突變，且具有豐富的多態(tài)性、易于高通量和自動化操作等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了其它分子標(biāo)記的不足，在玉米純度鑒定方面深受關(guān)注。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)了5種分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)（表1—表5），能夠有效加深對分子標(biāo)記技術(shù)的了解。

表1 RFLP分子標(biāo)記技術(shù)

表5 SNP分子標(biāo)記技術(shù)

2 分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 RFLP標(biāo)記技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是第一代分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是利用限制性內(nèi)切酶酶切所提取的DNA，使DNA產(chǎn)生了長度不等、分子質(zhì)量大小不同的片段，利用瓊脂糖電泳把這些片段分離開，經(jīng)特異性探針雜交可得到多態(tài)性的DNA片段，分析區(qū)別不同品種。RFLP標(biāo)記為共顯性，檢測結(jié)果不受環(huán)境條件和植株發(fā)育階段的影響，且具有多態(tài)性穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。Smith等[8]利用RFLP技術(shù)成功鑒定了78個(gè)玉米雜交種的純度，這表明RFLP技術(shù)可以有效應(yīng)用于種子純度鑒定。但由于該技術(shù)操作程序繁瑣、多態(tài)性低、對樣品DNA需求量大，且檢測中需要放射性同位素對操作人員身體有害，雖然目前已有非放射性同位素標(biāo)記方法可選擇，但由于價(jià)格昂貴嚴(yán)重影響了其推廣，所以RFLP標(biāo)記沒有被大范圍的應(yīng)用于玉米雜交種純度鑒定。

2.2 RAPD標(biāo)記技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）是基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)，它利用單一的隨機(jī)寡聚核苷酸對不同品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過電泳分離檢測DNA序列的多態(tài)性，從而鑒別不同的品種純度。RAPD技術(shù)可直接對基因組進(jìn)行多態(tài)性分析，且DNA用量較少、不需要進(jìn)行復(fù)雜的分子雜交、快速簡便，無放射性污染，成本低，分辨率和靈敏度高，所以在玉米品種純度鑒定方面有所應(yīng)用。顏廷進(jìn)等[9]利用RAPD技術(shù)對10個(gè)玉米自交系和他們組配的7個(gè)雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果表明該技術(shù)可以有效用于玉米純種鑒定。陳一華等[10]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了玉米自交系及其雙親的DNA指紋圖譜，可快速、準(zhǔn)確地鑒定雜交種的純度。但是，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對于不同引物之間的擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，多態(tài)性仍顯不足，對于以前未檢測過的新品種，很難在短時(shí)間內(nèi)篩選到合適的引物進(jìn)行鑒定，且表現(xiàn)為顯性，不能區(qū)分雜合型和純合型。因此，該技術(shù)在玉米純度鑒定中只能作為一種輔助技術(shù)，需要與其它技術(shù)結(jié)合使用。

表2 RAPD分子標(biāo)記技術(shù)

2.3 AFLP標(biāo)記技術(shù)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）與限制性酶切相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，兼具RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的靈敏性。AFLP的基本原理是將基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后形成不同分子量的隨機(jī)限制片段，用PCR擴(kuò)增后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，即可顯示限制性片段長度的多態(tài)性。目前，國外已將AFLP技術(shù)廣泛的應(yīng)用于玉米自交系鑒定，國內(nèi)也有部分學(xué)者嘗試?yán)迷摷夹g(shù)構(gòu)建玉米自交系的指紋圖譜。AFLP技術(shù)所需的樣品DNA用量少，檢測靈敏性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，多態(tài)性豐富，檢測效率高，是玉米純度鑒定的重要技術(shù)。美國先鋒公司最早開始利用AFLP技術(shù)進(jìn)行玉米雜交種的鑒定，并用于品種專利保護(hù)[11]。但該技術(shù)所需儀器設(shè)備昂貴、操作程序多、難度大，對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，限制了應(yīng)用范圍。

2.4 SSR標(biāo)記技術(shù)

簡單序列重復(fù)多態(tài)性（SSR）又稱微衛(wèi)星DNA，是近年來發(fā)展起來的分子標(biāo)記，由1~6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的重復(fù)序列。SSR基本原理是根據(jù)特定序列設(shè)計(jì)成對引物，然后用PCR擴(kuò)增出長度不同的PCR產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同個(gè)體間的SSR位點(diǎn)多態(tài)性[12]。SSR技術(shù)多態(tài)性豐富，共顯性，可以區(qū)分純合與雜合基因型，對DNA數(shù)量及質(zhì)量要求低，試驗(yàn)操作簡單，結(jié)果重復(fù)性好，是目前玉米種子純度鑒定中較為常用的技術(shù)之一。蓋樹鵬等[13]從30對SSR引物中篩選出6對表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)型的引物，建立了6個(gè)玉米雜交種純度鑒定的SSR標(biāo)記方法。李世聰?shù)萚14]從玉米20對SSR核心引物中篩選出8對多態(tài)性引物對2個(gè)玉米雜交種的純度進(jìn)行了有效檢測。李曉輝等[15]利用58對引物對21份玉米骨干自交系及其組配的13個(gè)雜交種進(jìn)行了SSR分析，表明SSR標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地鑒定玉米雜交種純度。目前，玉米SSR引物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了信息共享，為SSR標(biāo)記在玉米種子純度鑒定方面帶來了便利。隨著SSR技術(shù)研究的深入，應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)可視化的檢測結(jié)果讀取和自動分析，不需要聚丙烯酰胺凝膠顯示PCR結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了一定的高通量檢測，提高了玉米種子純度鑒定效率。

2.5 SNP標(biāo)記技術(shù)

SNP指在不同生物個(gè)體DNA序列中單堿基因插入、缺失、顛換、轉(zhuǎn)換等單核苷酸突變帶來的DNA序列多態(tài)性[16]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為第三代DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于玉米種子純度鑒定。SNP是目前種子純度鑒定最具發(fā)展?jié)摿Φ臉?biāo)記技術(shù)。SNP標(biāo)記主要具有三個(gè)方面的優(yōu)勢：一是在基因組中分布廣泛，通常是二等位多態(tài)性；二是高通量，易實(shí)現(xiàn)自動化分析，實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果直接由軟件讀出來，三是試驗(yàn)過程簡單，不需要做電泳分析，過程無污染[17]。姚宗澤等[18]等利用SNP技術(shù)對玉米品種“家佳榮2號”雜交種子純度進(jìn)行檢測，證明SNP分子標(biāo)記中HRM技術(shù)鑒定結(jié)果可靠，為雜交玉米種子純度鑒定方法提供了參考。李雪等[19]以11份玉米雜交種及其親本作為試驗(yàn)材料，分析比較SNP和SSR標(biāo)記在玉米品種真實(shí)性和純度的鑒定，發(fā)現(xiàn)SNP在數(shù)據(jù)整合共享和位點(diǎn)通量上更加具有技術(shù)優(yōu)勢。吳明生等[20]根據(jù)玉米多態(tài)性SNP位點(diǎn)對種子樣品進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確將混雜其中的親本鑒定出來，表明了TaqMan-SNP分型技術(shù)在鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和速度上均優(yōu)于SSR。因此，SNP標(biāo)記技術(shù)更適合于玉米種子純度的鑒定。

表3 AFLP分子標(biāo)記技術(shù)

3 前景與展望

分子標(biāo)記技術(shù)可以大大提高玉米雜交種純度鑒定效率，有效保障玉米種子質(zhì)量，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，促進(jìn)種業(yè)市場規(guī)范化、推動農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收貢獻(xiàn)了力量。本文綜述了五種分子標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種純度鑒定上的應(yīng)用，表明SNP作為新一代的分子標(biāo)記，相比于其它標(biāo)記技術(shù)優(yōu)勢顯著，在玉米基因組中多態(tài)性分布廣泛、標(biāo)記數(shù)量多，易實(shí)現(xiàn)全自動化分析。目前，SNP標(biāo)記被研究者廣泛應(yīng)用，特別是與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，技術(shù)優(yōu)勢不斷顯現(xiàn)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，更多更高效的新型分子標(biāo)記也將會逐漸涌現(xiàn)，可通過加大力度開發(fā)相關(guān)玉米DNA指紋圖譜，使玉米品種純度檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)程序化、簡單化和自動化，推動玉米種子純度鑒定研究取得新的成果，以此來服務(wù)玉米種業(yè)企業(yè)建立質(zhì)量內(nèi)控體系，幫助玉米種子質(zhì)量監(jiān)管部門實(shí)現(xiàn)高效監(jiān)管，最終促進(jìn)玉米生產(chǎn)、糧食增產(chǎn)和農(nóng)民增收，在甘肅省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中提供技術(shù)支撐。