Bt蛋白在晉南地區(qū)轉(zhuǎn)基因棉田中的殘留分析

關(guān)正君，霍艷林

(1. 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，運(yùn)城 044000； 2. 運(yùn)城學(xué)院 理科實(shí)驗(yàn)中心，運(yùn)城 044000)

隨著抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因植物的商業(yè)化生產(chǎn)和大面積種植，Bt毒蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)問題日益引起人們的重視。轉(zhuǎn)Bt基因棉花體內(nèi)的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物會通過根系分泌物或植株殘體等方式進(jìn)入自然界土壤環(huán)境中[1-2]。轉(zhuǎn)Bt基因作物表達(dá)的Bt蛋白進(jìn)入自然界土壤環(huán)境后能夠存留并保持一定的殺蟲活性，可直接作用于土壤生物體，最終可能會影響整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全，其潛在的危害性可能比土壤中殘留的商業(yè)Bt制劑前毒素危害性更大[3]。研究表明，由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的Bt殺蟲晶體蛋白進(jìn)入泥土后，可與腐殖酸、黏土礦物和有機(jī)礦物聚合體等泥土的表面活性顆?？焖?、緊密的結(jié)合，結(jié)合態(tài)的Bt毒素保持較高的殺蟲性，并且更不容易被微生物降解[4-5]。因此，研究和監(jiān)測轉(zhuǎn)Bt基因棉花植株體內(nèi)表達(dá)的Bt蛋白在自然界農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤環(huán)境中的殘留情況，對保護(hù)生態(tài)環(huán)境安全以及維持生物多樣性具有非常重要的意義[6-8]。

目前對轉(zhuǎn)Bt基因棉花釋放后對土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的研究報道相對較少，有的研究由于研究周期短、研究內(nèi)容不全面，因此很難揭示轉(zhuǎn)Bt基因棉花對農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的真正影響[9]。國內(nèi)外已報道的大多數(shù)研究都是通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)得出結(jié)論，而對Bt蛋白在自然界土壤環(huán)境中的存留、降解動態(tài)規(guī)律的研究工作比較缺乏[10]。本研究以晉南長期種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花的自然棉田為研究對象，探究轉(zhuǎn)Bt基因棉花在收獲時期不同區(qū)域植株根、葉Bt蛋白的含量變化與棉田根際土壤Bt蛋白殘留情況，以期為轉(zhuǎn)Bt基因作物生態(tài)安全方面提供理論基礎(chǔ)，也為轉(zhuǎn)Bt基因棉花合理的商業(yè)化種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品的采集

以晉南地區(qū)連續(xù)多年長期種植(>5 年)轉(zhuǎn)Bt基因棉花且種植面積較大的縣(市)自然棉田作為采集樣地，每個縣(市)選取3個樣地，每個樣地重復(fù)3次，在棉花收獲后期進(jìn)行樣品采集。選取運(yùn)城市鹽湖區(qū)龍居鎮(zhèn)(簡稱龍居)、運(yùn)城市鹽湖區(qū)金井鄉(xiāng)(簡稱金井)、永濟(jì)市開張鎮(zhèn)(簡稱永濟(jì))、臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)(簡稱縣底)和臨汾市大寧縣(簡稱大寧)這5個區(qū)域(表1)，采集轉(zhuǎn)Bt基因棉花大田中根際土壤與非根際土壤樣品、葉片和根部樣品。

表1 轉(zhuǎn)Bt基因棉田采集樣地信息

1.2 Bt蛋白的提取

采用美國Envirologix公司的Bt Cry1Ab/Cry1Ac酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)進(jìn)行Bt蛋白的提取[11]。分別稱取0.5 g土樣、0.1 g根和0.01 g葉片，將樣品分別放入離心管中。將根和葉加入適量提取液用液氮研磨，土樣中加入適量提取液，混勻，靜置30 min左右。將各樣品在6 000 r/min下離心5 min，提取上清液備用。由于有的樣品濃度太高，無法從酶標(biāo)儀上讀取準(zhǔn)確數(shù)值，須將預(yù)實(shí)驗(yàn)中獲得高Bt含量的樣品上清液稀釋10倍待用。

1.3 Bt蛋白含量的測定

采用美國Envirologix公司的Bt Cry1Ab/Cry1Ac酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進(jìn)行Bt蛋白含量的測定。在每個酶標(biāo)板樣孔中，加入50 μL Cry1Ab/Cry1Ac Enzyme Conjugate。迅速加入50 μL 各樣品提取液，快速混合均勻。用封口膜蓋上孔板以防止揮發(fā)，室溫放置1～2 h。小心移除封口膜，將其孔內(nèi)的溶液倒出，用清洗液沖洗3次，甩干孔內(nèi)的清洗液。加入100 μL Substrate 到每孔中，混勻，封上新的封口膜，放置15～30 min。加入100 μL Stop Solution 到每孔中，混勻，顏色會變黃。30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取OD450下吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Bt 蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件與SPASS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、分析與作圖，并運(yùn)用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt蛋白在轉(zhuǎn)Bt基因棉花農(nóng)田土壤中的殘留情況

本研究對晉南地區(qū)5個縣(市)轉(zhuǎn)Bt基因棉花收獲后期土壤Bt蛋白的殘留情況進(jìn)行了調(diào)查和測定。結(jié)果(表2)顯示：運(yùn)城市鹽湖區(qū)龍居鎮(zhèn)的轉(zhuǎn)基因棉田根際土壤中Bt蛋白殘留量最高，達(dá)0.167 2 ng/g(P<0.05)；臨汾市大寧縣次之，其根際土壤Bt蛋白殘留量為0.154 1 ng/g；永濟(jì)市開張鎮(zhèn)的轉(zhuǎn)基因棉田根際土壤中Bt蛋白殘留量最低，為0.116 6 ng/g(P<0.05)。與根際土壤相比，5個縣(市)轉(zhuǎn)Bt基因棉田的非根際土壤中Bt蛋白殘留量為0.055 8～0.063 3 ng/g，且各供試縣市間棉田非根際土壤的Bt蛋白殘留量差異不顯著。

在轉(zhuǎn)Bt基因棉花的收獲后期，同一個縣(市)的不同樣地間棉田土壤中的Bt蛋白殘留量有所不同(表2)。各縣市不同樣地棉田根際土壤Bt蛋白殘留量變化范圍為0.112 0～0.184 8 ng/g。永濟(jì)市開張鎮(zhèn)和運(yùn)城市鹽湖區(qū)金井鄉(xiāng)的不同樣地間根際土壤Bt蛋白殘留量均無顯著差異。運(yùn)城市鹽湖區(qū)龍居鎮(zhèn)樣地I和II的根際土壤Bt蛋白殘留量顯著高于樣地III(P<0.05)；臨汾市大寧縣樣地I的根際土壤Bt蛋白殘留量顯著高于樣地II和III，為0.164 7 ng/g(P<0.05)；臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)樣地II的根際土壤Bt蛋白殘留量最高(P<0.05)，達(dá)0.161 4 ng/g。各縣市不同樣地棉田非根際土壤Bt蛋白殘留量變化范圍為0.049 2～0.088 3 ng/g。永濟(jì)市開張鎮(zhèn)、運(yùn)城市鹽湖區(qū)龍居鎮(zhèn)和臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)這3個縣(市)的不同棉田樣地間非根際土壤Bt蛋白殘留量存在顯著差異(P<0.05)；永濟(jì)市開張鎮(zhèn)樣地II的非根際土壤中Bt蛋白殘留量最高(0.075 5 ng/g，P<0.05)；臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)樣地I的非根際土壤中Bt蛋白殘留量最低(0.049 2 ng/g，P<0.05)。

表2 不同區(qū)域轉(zhuǎn)Bt基因棉田土壤Bt蛋白含量

2.2 農(nóng)田中轉(zhuǎn)Bt基因棉花根和葉中Bt蛋白含量變化

在收獲后期，晉南地區(qū)5個供試縣(市)的轉(zhuǎn)Bt基因棉花根和葉片的Bt蛋白含量的測定結(jié)果(表3)表明：在轉(zhuǎn)Bt基因棉花的收獲后期，臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)的轉(zhuǎn)基因棉花根中Bt蛋白含量最高(P<0.05)，達(dá)18.09 ng/g；其他4個縣市次之，且龍居鎮(zhèn)轉(zhuǎn)基因棉花根的Bt蛋白含量最低，為13.19 ng/g (P<0.05)。供試5個縣(市)間轉(zhuǎn)基因棉花葉片Bt蛋白含量均存在顯著差異。永濟(jì)市開張鎮(zhèn)的轉(zhuǎn)基因棉花葉片Bt蛋白含量最高(120.83 ng/g，P<0.05)；臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)次之(111.35 ng/g)；臨汾市大寧縣轉(zhuǎn)基因棉花葉片的Bt蛋白含量最低(87.63 ng/g，P<0.05)。

表3 不同區(qū)域轉(zhuǎn)Bt基因棉花根和葉片Bt蛋白含量

供試5個縣(市)的不同樣地間，轉(zhuǎn)Bt基因棉花根的Bt蛋白含量較為相近，變化范圍為12.57～19.34 ng/g(表3)。永濟(jì)市開張鎮(zhèn)、運(yùn)城市鹽湖區(qū)金井鄉(xiāng)和龍居鎮(zhèn)以及臨汾市大寧縣4個縣(市)各樣地間，轉(zhuǎn)Bt基因棉花根的Bt蛋白含量無明顯差異；臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)樣地III轉(zhuǎn)Bt基因棉花根Bt蛋白含量最高，為19.34 ng/g，且顯著高于樣地I(P<0.05)。5個縣(市)不同樣地間轉(zhuǎn)Bt基因棉花葉片的Bt蛋白含量變化范圍為83.19～128.11 ng/g，均具有顯著差異。運(yùn)城市鹽湖區(qū)金井鄉(xiāng)的樣地III棉葉Bt蛋白含量顯著高于其他兩個樣地(P<0.05)。運(yùn)城市鹽湖區(qū)龍居鎮(zhèn)與臨汾市大寧縣的樣地I顯著高于同一縣(市)的其他兩個樣地(P<0.05)。

2.3 Bt蛋白在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的殘留情況

為了探究大田條件下轉(zhuǎn)Bt基因作物表達(dá)的Bt蛋白在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的殘留情況，本研究綜合分析了在轉(zhuǎn)Bt基因棉花收獲時期，晉南地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境中Bt蛋白在棉田土壤中的殘留情況、轉(zhuǎn)基因植株根、葉等營養(yǎng)器官中Bt蛋白的表達(dá)情況(圖1)。在晉南地區(qū)連續(xù)多年種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，Bt蛋白在土壤環(huán)境中的殘留量非常低，僅為0.146 9 ng/g±0.018 6 ng/g。在轉(zhuǎn)Bt基因棉花收獲期，其根、葉等營養(yǎng)器官中的Bt蛋白含量差異較大，根中Bt蛋白平均含量為14.96 ng/g±1.65 ng/g，葉片中Bt蛋白平均含量為104.21 ng/g±2.22 ng/g，約為根Bt蛋白含量的10倍。

圖1 轉(zhuǎn)基因棉田Bt蛋白總體殘留情況Figure 1 General situation of Bt protein residue in transgenic cotton field

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對晉南地區(qū)5個區(qū)域連續(xù)種植的不同轉(zhuǎn)基因棉花土壤中Bt蛋白殘留情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各采集樣地的轉(zhuǎn)基因棉田土壤中均有Bt蛋白的殘留，且存在一定的差異。同一樣地根際土和非根際土Bt蛋白含量也存在著差異。所有根際土檢測樣品的Bt蛋白含量為0.112 0～0.184 8 ng/g。這一研究結(jié)果與已有的研究報道結(jié)果相似，Bt蛋白在土壤環(huán)境中的殘留水平非常低[2,12-13]。由此推測，連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因棉花的棉田土壤中Bt蛋白的殘留可能對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)不會產(chǎn)生明顯的影響。本研究采用的ELISA檢測方法可檢測出Bt蛋白的下限為0.1 ng/g，低于該檢測值，則可認(rèn)為土壤中不存在Bt蛋白。在檢測過程中，各樣地非根際土的含量均小于0.1 ng/g。因此表明，連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因棉花的棉田非根際土壤中不存在Bt蛋白，與陳彥君等[6]和李自張[2]研究結(jié)果一致。Bt蛋白進(jìn)入土壤中不僅以簡單的游離方式存在，還會更多吸附土壤表面活性顆粒而殘留在土壤中[14]。本試驗(yàn)結(jié)果中不同樣地含有不同的Bt蛋白含量，可能由于不同采集樣地具有不同的土壤類型、土壤溫度以及土壤中微生物種類不同等原因所致[10]。

隨著秸稈還田技術(shù)的發(fā)展，作物植株的葉和根是Bt蛋白進(jìn)入土壤中的重要途徑，探明轉(zhuǎn)基因棉花葉、根中的Bt蛋白含量尤為重要，有助于為研究轉(zhuǎn)Bt基因棉花的不同營養(yǎng)器官對土壤Bt蛋白殘留的影響提供參考。本研究結(jié)果表明，各采集樣地轉(zhuǎn)Bt基因棉花根和葉中均可檢測到不同含量的Bt蛋白，且具有顯著差異。原因可能由于不同地區(qū)氣候條件不同，導(dǎo)致不同棉花品種生長的生態(tài)環(huán)境與生長情況各有差異[15-18]。在本試驗(yàn)中，檢測到大田連續(xù)種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉花，根中Bt蛋白含量為12.57～19.34 ng/g；葉中Bt蛋白為83.19～128.11 ng/g。表明轉(zhuǎn)基因棉花在收獲期，其葉和根中Bt蛋白含量明顯不同，從Bt蛋白進(jìn)入土壤的途徑來看，通過棉葉殘體進(jìn)入土壤中的Bt蛋白含量可能要高于通過根系進(jìn)入土壤中的量。因此，在棉花秸稈還田過程中可能會有大量Bt蛋白進(jìn)入土壤中，對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響[19-20]。有必要深入系統(tǒng)地研究和評價轉(zhuǎn)Bt基因棉花大田連續(xù)種植過程中Bt蛋白對棉田環(huán)境和周邊生態(tài)系統(tǒng)的影響，同時需要對外源蛋白在土壤中的殘留情況進(jìn)行長期連續(xù)監(jiān)測[21]。

本研究對晉南地區(qū)的5個縣(市)連續(xù)種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉花根際土壤的Bt蛋白殘留情況和根葉蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，各采集樣地根際土壤均有Bt蛋白殘留，且存在差異，Bt蛋白含量最高為0.184 8 ng/g，最低為0.112 0 ng/g。表明連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因棉花的土壤中可能只有低劑量的Bt蛋白殘留。轉(zhuǎn)Bt基因棉花的根和葉中均可檢測到Bt蛋白，且根和葉之間的Bt蛋白含量不同，有明顯差異。根中Bt蛋白含量為12.57～19.34 ng/g；葉中Bt蛋白含量為83.19～128.11 ng/g。表明在收獲期轉(zhuǎn)基因棉花葉中Bt蛋白含量較高，由此推測通過棉葉還田進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)中的Bt蛋白可能會造成Bt蛋白在土壤中累積。