電針對(duì)糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶的干預(yù)作用

蔣晨琳 李 想 陳芷羽 費(fèi)雪瑜 馬益琪 胡群祺 康玉蓉 陳盧杭 邵曉梅 方劍喬 何曉芬

糖尿病神經(jīng)痛是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，極大地影響糖尿病患者的生存質(zhì)量[1]。同時(shí)，因糖尿病神經(jīng)痛治療難度大，糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病致死的原因之一[2]。實(shí)驗(yàn)表明，在糖尿病神經(jīng)痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，背根神經(jīng)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)[3]。已有研究表明，磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（pp38MAPK）在病理狀態(tài)下易被激活，p-p38MAPK 在神經(jīng)病理性疼痛模型中表達(dá)上調(diào)，p-p38MAPK 上調(diào)產(chǎn)生痛覺過(guò)敏，對(duì)糖尿病研究意義重大[4-6]。糖尿病神經(jīng)痛較難治療，且多數(shù)治療藥物有較大的副作用。針刺能夠有效治療疼痛，其較好的效果和較少的不良反應(yīng)已廣為接受和使用。本實(shí)驗(yàn)以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠為研究對(duì)象，觀察電針對(duì)糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠機(jī)械痛閾和背根神經(jīng)節(jié)中pp38MAPK 表達(dá)的干預(yù)，探討電針治療糖尿病神經(jīng)痛的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠20 只，6～7周齡，體質(zhì)量（220±20）g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK（滬）2018-0006]，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按屏蔽環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)[SYXK（浙）2018-0012]，大鼠飼養(yǎng)采用嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，予以大鼠自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度恒定，12h 循環(huán)燈光。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（倫理審批號(hào)：ACUC-2018723-08）。

1.2 試劑與儀器 主要實(shí)驗(yàn)試劑：鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)S0130）；兔抗p-p38MAPK 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)4631）；驢抗兔Alexa Fluor488 IgG（H+L）二抗（美國(guó)Jackson 公司，批號(hào)711-545-152）。機(jī)械測(cè)痛儀（意大利UGO公司，型號(hào)37450）；冰凍切片機(jī)（德國(guó)Thermo 公司，型號(hào)NX50）；蔡司顯微鏡（德國(guó)ZEISS 公司，型號(hào)Image.M2）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 選框分組與電針干預(yù) 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法選取6 只大鼠作為空白組，空白組僅予以腹腔注射1mL檸檬酸緩沖液。其余14 只大鼠作為造模組，造模組大鼠禁食16h 后采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素（65mg/kg）建立糖尿病神經(jīng)痛模型[7]；其中1 只大鼠注射鏈尿佐菌素死亡，1 只大鼠注射鏈尿佐菌素后空腹血糖（FBG）并沒(méi)有下降故未納入實(shí)驗(yàn)；造模成功的12 只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和電針組，每組6 只。電針組于2 周后介入電針治療，取雙側(cè)足三里和昆侖穴，每天1 次，每次30min，干預(yù)1周。固定大鼠，大鼠穴位選取參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，用針灸針刺入足三里、昆侖穴，深度為3mm；進(jìn)針后連接電針儀，頻率選用2Hz，電流強(qiáng)度設(shè)為1～2mA，以大鼠肢體微微顫動(dòng)為度。

2.2 空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）檢測(cè) 分別在造模前、后1、2、3 周時(shí)，對(duì)各組大鼠予以尾靜脈采血，血糖監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)其FBG。

2.3 機(jī)械痛閾檢測(cè) 于造模前、后1、2、3 周時(shí)，采用動(dòng)態(tài)足底觸覺儀檢測(cè)大鼠機(jī)械痛閾。測(cè)痛方法參照文獻(xiàn)[8]，具體測(cè)定方法如下：將實(shí)驗(yàn)大鼠放到高為20cm 的金屬網(wǎng)上，用透明的圍箱限制大鼠，通過(guò)反光鏡控制角度，將刺激器放置在大鼠足爪下面，刺激器通過(guò)VONFREY 細(xì)絲提供設(shè)定的壓力（壓力最大設(shè)為50g），細(xì)絲對(duì)大鼠足底不斷增加壓力，從檢測(cè)到的閾值開始，直到大鼠收回爪子，機(jī)械測(cè)痛儀自動(dòng)記錄大鼠收回足爪瞬間所給予動(dòng)物的壓力即為大鼠痛閾值，共檢測(cè)5 次，最大值和最小值去除后取平均值。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)p-p38MAPK 蛋白表達(dá) 大鼠麻醉后，快速取大鼠腰4-腰6 背根神經(jīng)節(jié)，放置多聚甲醛溶液中固定4h，再置于蔗糖溶液中梯度脫水后放于超低溫冰箱冷凍保存。將大鼠背根神經(jīng)節(jié)切成厚度為10μm 的片子，TBST 沖洗，5%驢血清封閉1h后，按1∶800 稀釋比例加入兔抗p-p38MAPK 一抗，4℃過(guò)夜，37℃孵育1h，TBST 沖洗，加入1∶400 稀釋的熒光二抗，37℃避光孵育1h，TBST 沖洗后自然晾干，加抗熒光淬滅液后封片。在蔡司顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)并拍片。采用Image J 軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不同時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較 空白組、模型組和電針組三組大鼠造模前體質(zhì)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與空白組比較，模型組和電針組大鼠體質(zhì)量在造模后1、2、3 周時(shí)均顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g，）

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g，）

注：空白組僅予以腹腔注射1mL 檸檬酸緩沖液；模型組和電針組大鼠，禁食16h，予以腹腔注射65mg/kg 鏈脲佐菌素；電針組于2 周后介入電針治療，取雙側(cè)足三里和昆侖穴；與空白組比較，aP＜0.05

3.2 各組大鼠干預(yù)前后FBG 水平比較 造模前，空白組、模型組和電針組大鼠FBG 無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組和電針組大鼠在造模后1、2、3 周時(shí)FBG 顯著升高（P 均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)前后空腹血糖水平比較（mmol/L，）

表2 各組大鼠干預(yù)前后空腹血糖水平比較（mmol/L，）

注：空白組僅予以腹腔注射1mL 檸檬酸緩沖液；模型組和電針組大鼠，禁食16h，予以腹腔注射65mg/kg 鏈脲佐菌素；電針組于2 周后介入電針治療，取雙側(cè)足三里和昆侖穴；與空白組比較，aP＜0.05

3.3 各組大鼠干預(yù)前后機(jī)械痛閾比較 各組大鼠在造模前和造模后1 周時(shí)機(jī)械痛閾無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組大鼠機(jī)械痛域在造模后2、3 周時(shí)顯著降低，電針組大鼠機(jī)械痛閾在造模后2周時(shí)顯著降低（P 均＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠機(jī)械痛閾在造模后3 周時(shí)顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)前后機(jī)械痛閾比較（g，）

表3 各組大鼠干預(yù)前后機(jī)械痛閾比較（g，）

注：空白組僅予以腹腔注射1mL 檸檬酸緩沖液；模型組和電針組大鼠，禁食16h，予以腹腔注射65mg/kg 鏈脲佐菌素；電針組于2 周后介入電針治療，取雙側(cè)足三里和昆侖穴；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.4 各組大鼠干預(yù)前后腰4-腰6 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 造模后3 周，與空白組比較，模型組大鼠腰4-腰6 背根神根節(jié)上的p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著升高（P 均＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠腰4-腰6 背根神經(jīng)節(jié)上的p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著降低（P 均＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 電針對(duì)糖尿病神經(jīng)痛大鼠腰4-腰6 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

表4 各組大鼠干預(yù)前后L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，）

表4 各組大鼠干預(yù)前后L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，）

注：空白組僅予以腹腔注射1mL 檸檬酸緩沖液；模型組和電針組大鼠，禁食16h，予以腹腔注射65mg/kg 鏈脲佐菌素；電針組于2 周后介入電針治療，取雙側(cè)足三里和昆侖穴；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

4 討論

糖尿病神經(jīng)痛作為一種糖尿病常見并發(fā)癥導(dǎo)致的神經(jīng)性疼痛，治療難度大、治療費(fèi)用貴、致殘致死率高。電針具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但在臨床上應(yīng)用于糖尿病神經(jīng)痛并不多，故研究電針治療糖尿病神經(jīng)痛的相關(guān)機(jī)制，有利于推動(dòng)電針治療糖尿病神經(jīng)痛的臨床應(yīng)用。

腹腔注射鏈脲佐菌素是糖尿病神經(jīng)痛經(jīng)典的造模方法之一，糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠多在腹腔鏈脲佐菌素的1～3 周后成功造模[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病神經(jīng)痛模型，鏈脲佐菌素注射后1 周大鼠FBG 明顯升高，體質(zhì)量明顯下降，大鼠機(jī)械痛閾并沒(méi)有下降，說(shuō)明鏈脲佐菌素注射后1 周只是誘導(dǎo)了糖尿病模型并沒(méi)有形成糖尿病神經(jīng)痛模型；鏈脲佐菌素注射2 周后大鼠FBG 高于空白組，體質(zhì)量低于空白組，此時(shí)模型組大鼠的機(jī)械痛閾明顯低于空白組，表明鏈脲佐菌素注射2 周后成功建立了糖尿病神經(jīng)痛模型。電針是將針刺入腧穴得氣后，在針具上通過(guò)接近受刺動(dòng)物生物電的微量電流，以治療疾病的方法。因其較準(zhǔn)確的可控刺激參數(shù)而被廣泛應(yīng)用于臨床與實(shí)驗(yàn)中。此前本課題組He等[10]已證實(shí)，低頻電針緩解糖尿病神經(jīng)痛的效果優(yōu)于高頻電針，故本實(shí)驗(yàn)采用低頻2Hz。低頻電針干預(yù)從鏈脲佐菌素注射2 周后開始介入，持續(xù)干預(yù)1 周后，電針組大鼠機(jī)械痛閾明顯高于模型組，說(shuō)明電針有緩解糖尿病神經(jīng)痛的作用。

背根神經(jīng)節(jié)是傳遞從外周組織傷害性信息至中樞系統(tǒng)的“橋梁”，也是疼痛信息傳導(dǎo)的起點(diǎn)[11]。在病理狀態(tài)下，背根神經(jīng)節(jié)中的許多離子通道和受體會(huì)發(fā)生改變[12-13]。已有研究表明，DNP 模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK 表達(dá)明顯上調(diào)，p-p38MAPK 表達(dá)上調(diào)是糖尿病神經(jīng)痛發(fā)生的主要原因之一[14]。本研究結(jié)果顯示，鏈脲佐菌素注射3 周后，糖尿病神經(jīng)痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)的p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高，與以往的研究結(jié)果相一致；電針治療1 周后，糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)上的p-p38MAPK表達(dá)明顯下降。

本研究結(jié)果證實(shí)，低頻電針對(duì)糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠FBG 和體質(zhì)量沒(méi)有影響，可提高糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠的機(jī)械痛閾；電針可下調(diào)糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)的p-p38MAPK 陽(yáng)性細(xì)胞的高表達(dá)。綜上所述，電針能緩解糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠疼痛，可能與其有效抑制背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK表達(dá)有關(guān)。