水生軟體動(dòng)物中氯霉素的測(cè)定

陳 磊

（馬鞍山市市場(chǎng)監(jiān)管綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，安徽馬鞍山 243000）

氯霉素是一種廣譜抗菌藥物，由Ehrlichz在1947年首次分離得到[1]。氯霉素不僅對(duì)多數(shù)革蘭氏陽（陰）性菌有很好的抑制作用，而且對(duì)沙門氏菌病和大腸桿菌病有很好的治療作用，因此在疾病的預(yù)防和治療方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。但隨著廣泛應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，氯霉素可導(dǎo)致人類再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺乏病、灰嬰綜合癥、溶血性貧血等，具有毒副作用[4-5]。當(dāng)前許多國(guó)家在食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)都禁止使用氯霉素，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2019年頒布第250號(hào)公告《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留量》中規(guī)定氯霉素在動(dòng)物源性食品中不得檢出[6-7]。目前現(xiàn)行有效的氯霉素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中樣品處理的步驟煩瑣，試劑耗材使用量大，因此本文提出一種高效、準(zhǔn)確、環(huán)保的方法來檢測(cè)氯霉素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

AB 3500型液相色譜配備三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)，SCIEX）；ME204/02型萬分之一天平（瑞士，梅特勒-托利多）；Arium-Pro型純水系統(tǒng)（德國(guó)，賽多利斯）；S-700B型多參數(shù)測(cè)試儀（瑞士，梅特勒-托利多）；T18型分散機(jī)（德國(guó)，IKA）；0.22 μmPTFE微孔濾膜（德國(guó)，CNW）；HC-3018型離心機(jī)（中國(guó)，中科中佳）；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美國(guó)，waters）；24位固相萃取裝置（德國(guó)，CNW）；N-EVAP 5085型氮吹儀（美國(guó)，Organomation Associates）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氯霉素、D5-氯霉素均由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供；乙腈（LC-MS級(jí)，默克）；甲酸（LC-MS級(jí)，TCI）；甲醇（LC-MS級(jí)，默克）；乙酸乙酯（色譜純，TEDIA）；氨水（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥）；檸檬酸（分析純，阿拉丁）；磷酸氫二鈉（分析純，阿拉?。?；氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，國(guó)藥）；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

1.1.3 試劑配制

①Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至4.0±0.5，加水定容至 1 000 mL。②氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）。準(zhǔn)確稱取0.01 g 的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成 100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。③氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：移取1 mL 的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。④D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）。準(zhǔn)確稱取0.01 g 的D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 ⑤D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈配制成1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 ⑥D(zhuǎn)5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈配制成0.1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。⑦氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別移取0.01 ml、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、 1.00 mL 的氯霉素中間液和1 mLD5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液至 10 mL容量瓶中，并用初始流動(dòng)相定容至刻度配制濃度為 0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，的工作液，混勻。

1.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

月旭Ultimate C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：10 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）；負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度（TEM）：550 ℃；電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣：35 psi；噴霧氣（GS1）：55 psi；輔助加熱氣（GS2）：55 psi；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 氯霉素質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取2.0 （g精確至0.1 mg）置于50 mL離心管中加入100 μL， 20 mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，10 000 r/min勻漿提取1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液以2 mL/min的速度過HLB固相萃取柱（使用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化），待試樣完全流出后，依次用8 mL水和5 mL甲醇水溶液（甲醇∶水體積比為1∶19）淋洗，棄去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇洗脫，在40 ℃水浴下氮?dú)獯抵两?，? mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μmPTFE濾膜，待上機(jī)測(cè)試。氯霉素測(cè)試結(jié)果見圖1。

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)MRM色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

本文分別選用乙腈-Mcllvaine、堿化乙酸乙酯以及Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取液，對(duì)氯霉素進(jìn)行提取。發(fā)現(xiàn)這3種提取液對(duì)氯霉素的提取效率沒有明顯差異，為減少有機(jī)試劑的使用量，本文最終選擇了Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液為提取液。

2.2 固相萃取柱的選擇

HLB固相萃取柱中的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其對(duì)非極性至中等極性的酸性、中性、堿性目標(biāo)化合物均有高而穩(wěn)定的回收率。即使柱床干涸，回收率也不受影響。相同規(guī)格下HLB固相萃取柱的柱容量是傳統(tǒng)C18固相萃取柱的3倍。因此選用HLB固相萃取柱進(jìn)行樣品 分析。

2.3 工作曲線和檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)濃度分別為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，以氯霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，氯霉素的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系。線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。將混標(biāo)添加在空白基質(zhì)樣品中，在相同條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，按照3倍信噪比考察了氯霉素的檢出限（見表3）。

表3 線性參數(shù)和檢出限

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別稱取4種水生軟體動(dòng)物陰性樣品2.0 g（精確至 0.1 mg），按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6）

3 結(jié)論

本文建立了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液為提取液，連用HLB固相萃取柱凈化的方法對(duì)市售水生軟體動(dòng)物進(jìn)行前處理，使用液相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀測(cè)定氯霉素。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，經(jīng)濟(jì)適用型好，分離度符合要求，適合軟體動(dòng)物中氯霉素的定性和定量分析，為水生軟體動(dòng)物的市場(chǎng)監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。