肉蓯蓉醇提取物對小鼠腎虛及糖代謝的影響

宮霞 鄭麗圓 郁琳 盧必喬 王羽菲 王磊 孫兆貴

摘 要：現(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有抗疲勞、抗衰老、調(diào)節(jié)分泌代謝等作用。肉蓯蓉醇提物對腎虛小鼠的作用研究多集中表現(xiàn)在激素水平，但未見對小鼠糖代謝的研究報道。為探究蓯蓉醇提物對小鼠腎虛和糖代謝水平的影響，建立腎虛小鼠和糖尿病小鼠模型，連續(xù)灌胃21d后，檢測腎虛小鼠血清激素水平，測定酶活力，取睪丸組織進行石蠟包埋切片和HE染色，觀察其病理學(xué)狀態(tài)。檢測糖尿病小鼠體重、空腹血糖和總蛋白變化情況。結(jié)果表明：醇提物可使腎虛小鼠的體重增加，灌胃給藥組超氧化物歧化酶（SOD）活力降低，顯示醇提物有調(diào)節(jié)清除自由基的作用（p<0.001）;組織切片顯示，肉蓯蓉灌胃給藥組的生精小管內(nèi)精子數(shù)增多，表示醇提物使腎虛小鼠的生精能力提高。低劑量醇提物可顯著降低雌性糖尿病小鼠的血糖水平（p<0.05），醇提物可調(diào)節(jié)糖尿病造成的總蛋白水平異常（p<0.05）。因此，肉蓯蓉醇水提取物對雄性腎虛小鼠模型具有生殖改善作用，同時對糖尿病小鼠模型的血糖水平有一定的影響。

關(guān)鍵詞：荒漠肉蓯蓉;氫化可的松;腎虛;降血糖

中圖分類號 R285.5文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）13-0023-06

Abstract： Modern pharmacological studies show that Cistanche deserticola has the functions of anti-fatigue，anti-aging，and regulating secretion and metabolism.The effects of alcohol extract of Cistanche deserticola on mice with kidney deficiency were mainly studied on hormone level，and there was almost no study on glucose metabolism in mice.In order to investigate the effects of alcohol extract from Cistanches cistola on kidney deficiency and glucose metabolism in mice，the kidney deficiency mice and diabetic mice models were established.After 21 days of continuous gavage，serum hormone levels and enzyme activity of kidney deficiency mice were detected.Testis tissues were taken for paraffin-embedded sections and HE staining to observe the pathological status.The changes of body weight，fasting blood glucose and total protein in diabetic mice were detected.The results showed that the alcohol extract could increase the body weight of mice with kidney deficiency.The activity of superoxide dismutase （SOD） decreased in the gavage group，indicating that the alcohol extract could regulate the free radical scavenging effect （p<0.01）.The number of sperms in the spermatogenic tubule of Cistanche deserticola groups was increased，indicating that the spermatogenic ability of mice with kidney deficiency was improved by alcohol extract.Low dose alcohol extract could significantly reduce the blood glucose level of female diabetic mice，and alcohol extract could regulate the abnormal total protein level caused by diabetes （p<0.05）. Cistanche deserticola alcohol water extract has reproductive improvement effects on male kidney deficiency mouse model，and has certain effects on blood glucose level of diabetic mouse model.

Key words： Cistanche deserticola;Hydrocortisone;Deficiency of the kidney;Blood sugar level

肉蓯蓉產(chǎn)自我國西部地區(qū)沙漠地帶，是一種特殊的寄生植物，含有多種活性成分，如苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖、氨基酸、生物堿、微量元素[1-2]等。相關(guān)研究顯示，肉蓯蓉除了具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[3]、抗疲勞[4]、潤腸通便[5]、神經(jīng)保護[6]等作用之外，還可以起到雄性激素的作用[7]。目前，關(guān)于肉蓯蓉醇提物對腎虛小鼠的作用研究主要集中于激素水平，且國內(nèi)外未見研究醇提物對小鼠血糖水平的影響，只有少數(shù)研究報道包含肉蓯蓉的復(fù)方藥劑具有降糖作用[8-9]。2018年4月，國家衛(wèi)計委將肉蓯蓉（荒漠）列為藥食同源的物質(zhì)，大大增加了其市場與臨床應(yīng)用的潛力，但目前市場上關(guān)于肉蓯蓉的功能產(chǎn)品還不是非常知名，人們對于肉蓯蓉的認識并不多，主要產(chǎn)品仍為肉蓯蓉酒[10]、茶包一類。隨著中醫(yī)不斷被國人所重視，中藥的相關(guān)基礎(chǔ)研究也顯得尤為迫切。肉蓯蓉作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有廣泛的研究價值和開發(fā)應(yīng)用的潛力。

本研究擬建立氫化可的松誘導(dǎo)的雄性腎陽虛小鼠，記錄小鼠自灌胃肉蓯蓉后的體重變化，測定血清激素水平和組織酶活力，對小鼠睪丸組織進行病理研究來探究肉蓯蓉對腎虛小鼠的影響。建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，檢測小鼠自灌胃肉蓯蓉后的體重和空腹血糖變化，以及血漿總蛋白含量，以探究肉蓯蓉對小鼠糖代謝的影響，以期為肉蓯蓉這一藥食兩用的植物資源的研究開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 C57BL/6J雄性小鼠和ICR小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責(zé)任公司;鏈脲佐菌素，上海源葉生物公司;氫化可的松，上海源葉生物公司;野生荒漠肉蓯蓉，內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善地區(qū);戊巴比妥鈉，Sigma公司;小鼠游離血清睪酮（T）酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠血清促性腺激素釋放激素（GnRH）試劑盒和丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，南京建成有限公司;伊紅溶液（B液），上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術(shù)有限公司;蘇木素溶液，上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術(shù)有限公司;通用型組織固定液，武漢賽維爾生物科技有限公司;食用乙醇，江蘇省華興生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 MS32000LE 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;TDL-5-A離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-S恒溫水浴鍋，江蘇國勝實驗儀器廠;RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海況勝實業(yè)發(fā)展有限公司;-80℃低溫冰箱，HARRIS公司;酶標(biāo)儀（MR3），賽默飛世爾（上海）儀器有限公司;歐姆龍血糖儀HGM-121，蘇州爾達醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉蓯蓉提取物的制備 挑選新鮮的肉蓯蓉，切片，取100g粉碎，粉碎時以料液比1∶2加入蒸餾水，打成糊狀勻漿，置于冰箱冷凍存放備用。將肉蓯蓉勻漿和52%的食用酒精按1∶16的比例混合，65℃水浴加熱46min，8000r/min離心5min后將濾渣加入同第1次等量的酒精水溶液，同等條件再次水浴加熱，2次加入的乙醇水溶液共計10000mL，將2次離心出的上清液進行濃縮，使乙醇蒸發(fā)出來，濃縮條件為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀85℃加熱50min，得到2200mL濃縮液，即為肉蓯蓉醇提取液。

1.3.2 動物模型建造及分組

1.3.2.1 腎虛小鼠動物模型 6周齡的C57BL/6J雄性小鼠引進后適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，隨機選取5只小鼠作為空白對照組，每天進行滅菌生理鹽水皮下注射，0.1mL/只，1d1次，連續(xù)10d。其余26只小鼠用氫化可的松皮下注射造模，按照25mg/kg BW（體重）的劑量連續(xù)注射10d[11-16]。小鼠如果有拱背蜷縮、肢尾冷、精神不振等腎虛癥狀，則認為氫化可的松誘導(dǎo)雄性小鼠腎虛模型造模成功。

腎陽虛小鼠模型建造成功后，空白組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，低劑量組和高劑量組分別按藥物臨床用藥量的1倍，2倍計算，1d灌胃1次，連續(xù)灌胃21d。具體分組情況為：C0空白組（5只），以0.4mL/（kg·BW）的灌胃劑量灌服純水;M0模型組（8只）：以0.4mL/（kg·BW）的灌胃劑量灌服純水;M1低劑量組（9只），灌胃劑量為1.6mL/（kg·BW）的肉蓯蓉醇提取液;M2高劑量組（9只），灌胃劑量為3.2mL/（kg·BW）的肉蓯蓉醇提取液。

1.3.2.2 糖尿病小鼠模型 8周齡ICR雌性小鼠20只，雄性小鼠21只。雌雄小鼠分別隨機分為：空白組（C0），模型組（M0），肉蓯蓉低劑量組（M1），肉蓯蓉高劑量組（M2），每組各5只或6只，每組灌胃劑量同腎虛組。除空白組（C0）外，其余小鼠8周齡開始每日喂高脂飼料，喂28d后（11周齡）注射鏈脲佐菌素[17-19]120mg/（kg·BW），造模前將ICR小鼠禁食12h。72h后采血測定空腹血糖（前一晚動物禁食）。第1次測血糖未達標(biāo)，12周齡重復(fù)1次實驗（注射時間點、劑量均一致），空腹血糖≥11.1mmol/L視為糖尿病動物模型造模成功。

1.3.3 主要檢測指標(biāo)的測定 每周測量小鼠的體重，每周對ICR小鼠剪尾取血，用血糖檢測系統(tǒng)測定空腹血糖水平，并比較各組差異。灌胃實驗結(jié)束后，心臟采血，血液以3500r/min離心15min。血清分離后，用ELISA法檢測C57BL/6J小鼠血清中睪酮（T）、促性腺激素釋放激素（GnRH）的激素水平。小鼠斷頭處死后，速取睪丸組織，稱重，以組織重：生理鹽水（mg∶mL）=1∶0.9，離心15min，組織上清液冷凍保存?zhèn)溆?，酶?lián)免疫吸附測定睪丸組織丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力，操作均嚴格按照試劑盒說明進行。ICR小鼠每組抽取3～4個樣品取其血漿送往上海實驗動物研究中心，對總蛋白水平（TP）進行檢測。

1.3.4 蘇木素-伊紅（HE）染色 小鼠取血完畢后立即處死小鼠，立即取出睪丸和附睪，將其分別精確稱重。小鼠睪丸組織取材后，石蠟包埋切片，再用蘇木精染液染色2min使細胞核呈藍色，0.1%伊紅染液染色2min，使細胞質(zhì)呈紅色。

1.3.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準誤差（[X]±S）表示，顯著性標(biāo)準為P<0.05，極顯著性指標(biāo)為P<0.01，組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義采用ANOVA（單因素方差分析）中的LSD（最小顯著差法）和Duncan（多范圍檢驗法），數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件處理。各組數(shù)據(jù)取試劑盒靈敏度范圍內(nèi)的，超出范圍部分的數(shù)據(jù)應(yīng)舍去。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉蓯蓉醇提物對雄性腎虛小鼠的影響

2.1.1 小鼠體重的變化 由圖1可知，在注射氫化可的松造模后，模型組M0的體重增長小于空白組C0，提示雄性小鼠腎虛模型建造成功，為以后的實驗打下基礎(chǔ)。給藥組在10周齡之后體重出現(xiàn)增長，低劑量組M1的體重增長1.54g，高劑量組M2的體重增長1.09g，而空白組C0增長0.95g，提示肉蓯蓉提取物可能有促進雄性腎虛小鼠體重增加的作用，但是各組之間差異不顯著。

2.1.2 睪酮（T）檢測結(jié)果 與模型組相比，本試驗小鼠睪酮組間差異顯著性為p>0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由圖2可知，模型組M0小鼠睪酮水平與C0相比沒有太大變化，與M0相比，低劑量組M1小鼠睪酮降低，高劑量組M2小鼠睪酮水平均值（2.71ng/mL）將近M0的3倍（1.07ng/mL），說明高劑量的肉蓯蓉提取物對雄性小鼠的睪酮具升高作用，對腎虛小鼠的雄性激素有促進分泌的作用，而低劑量的肉蓯蓉提取物卻呈現(xiàn)對小鼠雄性激素的分泌有抑制的拮抗作用。

2.1.3 促性腺激素釋放激素（GnRH）檢測結(jié)果 小鼠促性腺激素釋放激素各組間差異顯著性為p=0.342>0.05，即本次試驗小鼠各組間促性腺激素釋放激素?zé)o顯著性差異，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。由表1和圖3可知，與模型對照組M0相比，肉蓯蓉提取物使給藥組小鼠M1、M2的促性腺激素釋放激素升高，提示肉蓯蓉提取物可能促進腎虛小鼠釋放促性腺激素釋放激素，促進雄性激素分泌，且高劑量組M2的促進效果更強。

2.1.4 丙二醛（MDA）檢測結(jié)果 經(jīng)SPSS差異顯著性分析得出，各組間差異顯著性p>0.05，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。由由表2和圖4可知，模型對照組M0的丙二醛含量比空白組C0的更高，即腎虛小鼠的丙二醛含量升高，說明機體的膜脂過氧化程度升高，組織抗氧化程度降低。與M0相比，給藥組M1、M2的MDA含量降低，說明肉蓯蓉提取物能清除脂質(zhì)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物丙二醛，使膜系統(tǒng)得到一定程度的恢復(fù)。

2.1.5 超氧化物歧化酶（SOD）檢測結(jié)果 SOD各組間差異顯著性為p<0.01。由圖5和表3可知，模型組M0與低劑量組M1的差異顯著性為p<0.05，C0組與各組間差異顯著性均為p<0.05。腎虛小鼠SOD的活力顯著增加，為空白組的2.5倍，可能是由于氫化可的松這種激素引起的小鼠SOD活力的顯著改變。肉蓯蓉提取物對腎虛小鼠的SOD活力有一定降低作用，說明肉蓯蓉提取物可以使小鼠SOD的活力趨于正常水平，說明其對小鼠體內(nèi)自由基代謝狀態(tài)有一定調(diào)節(jié)作用。

2.1.6 睪丸組織病理學(xué)影響 10倍光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸和附睪病理組織切片，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，正常組C0小鼠睪丸生精小管基膜完整，膜內(nèi)可見致密且結(jié)構(gòu)正常的細胞，樹枝狀的支持細胞較多，生精能力強，生精小管管腔內(nèi)可見大量精子。模型對照組M0小鼠生精小管基膜變薄，基膜內(nèi)間質(zhì)細胞排列不整齊，支持細胞減少，腔內(nèi)間質(zhì)出現(xiàn)較大空隙，腔內(nèi)精子減少。與M0組相比，肉蓯蓉給藥組M1、M2小鼠睪丸生精小管基膜較完整，支持細胞較多，間質(zhì)細胞排列較規(guī)整，精子數(shù)增多，生精小管管腔內(nèi)間質(zhì)的空隙相對于模型組都有一定程度的減小。

2.2 肉蓯蓉醇提物對小鼠糖代謝的影響

2.2.1 肉蓯蓉醇提物對小鼠體重的影響

2.2.1.1 肉蓯蓉醇提物對雄性糖尿病小鼠體重的影響 在連續(xù)21d喂養(yǎng)高脂飼料后，雄鼠體重在不斷增加。第1次和第2次注射鏈脲佐菌素（11周齡和12周齡）后，進行灌胃，M1組體重在實驗期間不斷下降（p<0.05），說明低劑量組可以顯著降低糖尿病小鼠的體重，M2與M0組相比體重變化趨勢基本一致（見圖7）。而M0組體重與C0組相比更大，這可能是在實驗過程中小鼠發(fā)育不均的原因，有待進一步研究。

2.2.1.2 肉蓯蓉提取物對雌性糖尿病小鼠體重的影響 連續(xù)21d喂養(yǎng)高脂飼料后，雌鼠體重不斷增加，在第1次和第2次注射鏈脲佐菌素（11周齡和12周齡）后，所有雌鼠體重都在緩慢下降。灌胃后，與M0組相比，M1組顯著降低了小鼠的體重下降率（p<0.05），M2組極顯著降低了小鼠的體重下降率（p<0.01）（見圖8）。2組相比，M2組的改善效果最佳。

2.2.2 肉蓯蓉醇提物對小鼠空腹血糖水平的影響

2.2.2.1 肉蓯蓉醇提物對雄性糖尿病小鼠空腹血糖的影響 從表4可以看出，與C0比較，M0組血糖并沒有升高，說明與M0組相比，M1組在灌胃7d后空腹血糖下降8.45%，在灌胃14d后空腹血糖水平下降1.03%，在灌胃21d后空腹血糖水平下降3.58%。由此可以看出，M1組對雄性糖尿病小鼠表現(xiàn)出降糖作用，但差異不顯著。與M0組相比，M2組在灌胃7d后空腹血糖下降2.82%，在灌胃14d后空腹血糖水平升高28.52%（p<0.05），灌胃21d后空腹血糖水平升高52.88%（p<0.01）。這可能是因為肉蓯蓉提取物濃度過高而使小鼠在灌胃14d后血糖恢復(fù)到之前的水平，有待進一步研究分析。

2.3.2.2 肉蓯蓉提取物對雌性糖尿病小鼠空腹血糖的影響 從表5可以看出，試驗開始時，M1、M2組與M0組雌性小鼠空腹血糖含量無顯著差異。與M0組相比，M1組在灌胃1周后空腹血糖升高24.66%（P<0.01），在灌胃14d后空腹血糖水平下降14.95%（p<0.01）。與M0組相比，M2組在灌胃7d后空腹血糖升高20.09%（p<0.05），在灌胃14d后空腹血糖水平下降12.77%（p<0.05），推測肉蓯蓉提取物在一定時間內(nèi)對血糖有顯著的降糖效果。

3 討論

（1）探究肉蓯蓉醇提物對腎虛小鼠的作用研究顯示，從小鼠的體重變化來看，模型組小鼠的體重增加較空白組更為緩慢。肉蓯蓉醇提物灌胃給藥21d后，給藥組小鼠體重的增加均大于空白組和模型組，提示肉蓯蓉對腎虛小鼠有一定的治療作用。從血清激素水平來看，肉蓯蓉提取物可能提高了睪丸的生精能力。超氧化物歧化酶（SOD）各組間差異顯著性為p<0.01，說明肉蓯蓉提取物可以調(diào)節(jié)小鼠自由基的代謝水平。從組織病理學(xué)的角度來看，觀察睪丸病理組織切片，肉蓯蓉給藥組M1、M2小鼠睪丸生精小管管腔內(nèi)間質(zhì)的空隙相對于模型組都有一定程度的減小，說明肉蓯蓉提取物對腎虛小鼠具有一定的治療作用。但丙二醛、睪酮和促性腺激素釋放激素水平均無顯著變化，說明肉蓯蓉粗提物在對這些激素的調(diào)控作用不夠特異，在體綜合調(diào)節(jié)作用掩蓋了其療效的顯著呈現(xiàn)。

（2）探究肉蓯蓉醇提物對小鼠糖代謝的作用研究顯示，對于雌性糖尿病小鼠，與M0組相比，M1組體重顯著增加（p<0.05），M2組體重極顯著增加（p<0.01），說明肉蓯蓉醇提物能增加糖尿病小鼠的體重?？崭寡撬阶兓瘉砜?，對于雄性糖尿病小鼠，灌胃過程中，低劑量組對雄性糖尿病小鼠表現(xiàn)出降糖作用（p<0.05）。但M2組小鼠在灌胃兩周后空腹血糖水平明顯升高，這可能是肉蓯蓉濃度過高引起的，有待于后續(xù)的進一步研究。對于雌性糖尿病小鼠，M1組和M2組均在灌胃兩周后表現(xiàn)出降糖作用（p<0.05），但在灌胃21d后血糖又升高到灌胃之前的水平，推測是由于肉蓯蓉醇提取物在一定時間內(nèi)對血糖有顯著的降糖效果，但效果不穩(wěn)定。接下來，需要對不同濃度和更長時間的灌胃實驗進行進一步研究，以明確肉蓯蓉提取物的降血糖和改善腎虛的作用機制。

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（責(zé)編：張宏民）