銅綠假單胞菌生物膜形成和發(fā)育分子機(jī)制研究進(jìn)展

馮禮尚

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）也稱綠膿桿菌，是一種革蘭氏陰性好氧的條件致病菌，在自然界廣泛分布，體弱多病免疫力低下的人群以及傷口易感染此菌，PA還是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。該菌極易形成生物膜（biofilms，BF），使其具有很強(qiáng)的適應(yīng)不良環(huán)境的能力，它的感染性、致病性、耐藥性以及對(duì)宿主免疫的抵抗性都與生物膜的形成有關(guān)[1-4]。本文根據(jù)近五年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于銅綠假單胞菌生物膜（PA-BF）形成和發(fā)育分子機(jī)制的研究進(jìn)展，從PA-BF結(jié)構(gòu)的分子組成、形成和發(fā)育的分子機(jī)制、基因的轉(zhuǎn)移和調(diào)控三方面作以綜述。

1 銅綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的分子組成及其作用

生物膜（Biofilms，BF），也稱生物被膜或菌膜（Pellicle），是由細(xì)菌等微生物在人體和動(dòng)植物體等表面黏附生長(zhǎng)，并被自分泌的胞外多聚物基質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）包裹所形成的有組織、系統(tǒng)化的微生物群落，呈現(xiàn)膜狀的形態(tài)結(jié)構(gòu)，屬于微生態(tài)系統(tǒng)范疇。生物膜中具有縱橫交錯(cuò)的水管系統(tǒng)，用于吸收和運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并排泄廢物，生物膜中的水分占90%以上。EPS包括胞外多糖（Exopolysaccharides）、胞外DNA（Extracellular DNA，eDNA）、蛋白質(zhì)以及鞭毛（Flagellum）、菌毛（Pili）等細(xì)菌附屬物[5-6]。

1.1 胞外多糖

與PA-BF形成有關(guān)的胞外多糖主要是Psl、Pel和藻酸鹽多糖。Psl多糖由psl（polysaccharide synthesis locus）基因座編碼的一族酶合成。psl基因座含有15個(gè)基因（psl A～O），組成一個(gè)操縱子。Psl多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖構(gòu)成的五糖單元重復(fù)形成，在PA-BF形成的初期使菌體黏附定植在載體表面并維持BF結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Pel多糖合成酶系由7個(gè)pel基因組成的操縱子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，Pel多糖有利于PA在氣-液交界面形成菌膜，對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)具有支持和保護(hù)作用。藻酸鹽（alginate）的結(jié)構(gòu)由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的二聚體單元重復(fù)形成，具有黏附性，其大量表達(dá)增加生物膜細(xì)菌的耐藥性和抗宿主免疫攻擊能力。藻酸鹽合成和分解有關(guān)的基因定性的確定了二三十個(gè)，其中algA、algC、algD參與GDP-甘露糖醛酸（藻酸鹽前體）的合成；algG基因編碼C5-甘露糖醛酸異構(gòu)酶并防止藻酸鹽的降解；algD基因編碼GDP-甘露糖脫氫酶?；騧ucA～D抑制藻酸鹽合成[7-9]。

1.2 胞外DNA

胞外DNA（eDNA）是許多微生物生物膜中將菌細(xì)胞聯(lián)結(jié)為整體的主要基質(zhì)。PA-BF含有大量的eDNA，對(duì)于BF的形成和形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用。eDNA來(lái)源于PA-BF中衰老死亡菌細(xì)胞的裂解，或是QS誘導(dǎo)部分菌體釋放的DNA[10]。在PA-BF形成的早期，eDNA作為菌體與載體表面或菌體之間的黏附劑而促進(jìn)BF的形成；eDNA對(duì)于成熟期的BF具有穩(wěn)定作用；在BF生長(zhǎng)期，細(xì)菌處于感受態(tài)，大量釋放出的eDNA為基因在菌體之間轉(zhuǎn)移和交換提供了遺傳素材，提高了BF菌群的基因轉(zhuǎn)化率和遺傳多樣性[11]。

1.3 生物膜黏蛋白

凝集素（Lectin）是一類能與糖單元結(jié)合的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞識(shí)別和黏附反應(yīng)中起重要作用。PA中與巖藻糖（Fucose）特異結(jié)合的凝集素lecA和lecB能在不同的菌細(xì)胞之間或菌體與胞外基質(zhì)之間形成聯(lián)結(jié)。PA還分泌大分子量的黏附蛋白（Adhesins），如LapA和LapF，能牢固地將菌細(xì)胞黏結(jié)在一起，有利于BF結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和抵抗不良的環(huán)境因素。

1.4 細(xì)菌細(xì)胞附屬物——鞭毛和菌毛

PA鞭毛（Flagella）介導(dǎo)的菌體運(yùn)動(dòng)和黏附作用有利于菌體的遷移和微菌落的形成。菌毛（Pili）也叫纖毛（Fimbriae），由菌毛蛋白（Pilin）構(gòu)成，包括普通菌毛和性菌毛，這兩種菌毛都具有黏附和促進(jìn)菌體移動(dòng)的作用，但性菌毛數(shù)量較少，能介導(dǎo)質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)在細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移。IV型菌毛在PA-BF形成中具有重要作用。PA合成的Cup纖毛，在BF形成的初期和成熟期有利于菌體之間發(fā)生交聯(lián)。

2 銅綠假單胞菌生物膜形成和發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理

2.1 PA-BF形成和發(fā)育的顯微過程

PA-BF的形成和發(fā)育可分為5個(gè)階段。（1）菌體與載體表面的附著，其中鞭毛和菌毛介導(dǎo)遷移和黏附，胞璧多糖作為黏附配體。（2）黏附期（Attachment）：菌細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)產(chǎn)生不可逆的黏附，并能黏聯(lián)其他的細(xì)菌著附。（3）形成微菌落：菌細(xì)胞定植后繁殖或黏附其他菌細(xì)胞形成微群落。（4）生物膜發(fā)育成熟：BF生長(zhǎng)增厚，面積加大，形成完整的自給自供的微生態(tài)系統(tǒng)。（5）生物膜的分解與散播：隨著BF的生長(zhǎng)和加厚，會(huì)給BF內(nèi)細(xì)菌帶來(lái)不利影響，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧耗竭、一氧化氮等代謝廢物積累、群體密度加大等，這些因素將誘導(dǎo)BF的分解和播散[12-13]。

2.2 群體密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)BF形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制

群體密度感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum sensing system，QS）是指細(xì)菌間通過分泌化學(xué)信號(hào)分子調(diào)控特定基因表達(dá)與群體行為的一種生態(tài)生理機(jī)制。根據(jù)細(xì)菌合成的信號(hào)分子和感應(yīng)機(jī)制不同，QS分為3種類型。（1）G-菌（革蘭陰性細(xì)菌）的LuxI/R系統(tǒng)，利用酰基高絲氨酸內(nèi)酯（Acylhomoserine lactone，AHL）類分子作為信號(hào)分子，LuxI是合成AHL類信號(hào)分子的酶，LuxR是能與AHL類分子結(jié)合并被激活的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。LuxR能夠識(shí)別基因啟動(dòng)子區(qū)域的luxbox序列。（2）G+菌利用寡肽（oligopeptide）作為信號(hào)分子，寡肽信號(hào)分子與細(xì)菌細(xì)胞膜上特異受體結(jié)合后激活細(xì)胞膜上的組氨酸蛋白激酶，使激酶的組氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活靶基因的表達(dá)。（3）第三類密度感應(yīng)系統(tǒng)結(jié)合了前二者的特點(diǎn)，用AHL類分子作為信號(hào)分子，其信號(hào)傳導(dǎo)則采用了磷酸化-去磷酸化的雙因子調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控蛋白酶的活性與基因表達(dá)。PA有l(wèi)as、rhl與pqs三套相互關(guān)聯(lián)的QS。las和rhl屬于LuxI/R系統(tǒng)，分別以長(zhǎng)鏈12碳?；呓z氨酸內(nèi)酯（HO-3-C12-HSL）和短鏈的4碳?；呓z氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）作為信號(hào)分子，其受體蛋白分別是LasR和RhlR[14]。pqs系統(tǒng)利用喹諾酮類作為信號(hào)分子，受體蛋白是PqsR。Las系統(tǒng)正向調(diào)節(jié)rhl和pqs系統(tǒng)的基因表達(dá)。生物膜內(nèi)細(xì)菌群體的密度足夠高時(shí)，激活QS系統(tǒng)并調(diào)控BF形成和分解有關(guān)的基因表達(dá)[15]。pqs系統(tǒng)直接控制著eDNA的釋放，eDNA介導(dǎo)BF可運(yùn)動(dòng)性PA與非運(yùn)動(dòng)性PA的相互作用，促進(jìn)蘑菇狀微菌落的形成。在PA-BF形成的早期，las系統(tǒng)的AHL信號(hào)分子激活菌體內(nèi)降解c-di-GMP的酶系促進(jìn)Psl多糖而抑制Pel的合成。QS還調(diào)節(jié)浮游細(xì)菌的表面運(yùn)動(dòng)能力與細(xì)菌的群體運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響B(tài)F的形成與分解。rhl系統(tǒng)調(diào)控鼠李糖脂（Rhamnolipid）的合成，實(shí)驗(yàn)研究表明，PA分泌的鼠李糖脂能使該菌在半固體表面產(chǎn)生涌動(dòng)，促進(jìn)微菌落的形成[16]。干擾和淬滅QS信號(hào)分子是控制細(xì)菌BF形成的重要策略，具體方法是合成或篩選QS信號(hào)分子類似物，干擾QS信息傳遞[17-20]，或者設(shè)計(jì)降解QS信號(hào)分子的酶。

2.3 第二信使c-di-GMP系統(tǒng)對(duì)PA-BF形成和發(fā)育的調(diào)控

G-菌的第二信使c-di-GMP（環(huán)鳥苷二磷酸）系統(tǒng)是其生理活動(dòng)的調(diào)控中心，c-di-GMP在基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后等多j個(gè)水平調(diào)控基因表達(dá)[21]。c-di-GMP由鳥苷二磷酸環(huán)化酶（Diguanylate cyclase，DGC）催化兩分子GTP合成，可被磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）分解為沒有活性的pGpG。DGC含有GGDEF活性結(jié)構(gòu)域，而PDE具有EAL或HDGYP結(jié)構(gòu)域。許多G-菌的蛋白質(zhì)具有GGDEF或/和EAL結(jié)構(gòu)域，組成了GGDEF/EAL蛋白超家族。但是G+菌的蛋白質(zhì)不含或很少有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域，不能利用c-di-GMP調(diào)控其基因活動(dòng)。PA的c-di-GMP水平與多糖合成基因轉(zhuǎn)錄活性及BF形成呈正相關(guān)，高水平c-di-GMP促進(jìn)Pel多糖、藻酸鹽的合成及BF形成，反之則增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和毒素的表達(dá)，抑制BF形成或促進(jìn)其分解。菌體內(nèi)的c-di-GMP水平還決定細(xì)菌從浮游生活向BF生存方式的轉(zhuǎn)變。

c-di-GMP系統(tǒng)調(diào)控PA-BF形成和發(fā)育的分子機(jī)制：c-di-GMP通過與受體蛋白酶或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而調(diào)控BF多糖合成有關(guān)酶或基因的活性。c-di-GMP與蛋白酶Alg44結(jié)合促進(jìn)藻酸鹽合成，與蛋白酶PelD結(jié)合激活Pel的合成，與轉(zhuǎn)錄因子FleQ結(jié)合激活Pel基因操縱子的表達(dá)。FleQ是一個(gè)多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，還能激活鞭毛蛋白合成基因的轉(zhuǎn)錄，可見c-di-GMP在菌體的運(yùn)動(dòng)與BF的形成中具有協(xié)調(diào)作用。

菌細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平的調(diào)控：菌細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP濃度是由一系列含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的對(duì)環(huán)境因素敏感的蛋白質(zhì)調(diào)控，其表達(dá)水平與活性控制著c-di-GMP的水平。WSP（Wrinkly spreader phenotype）系統(tǒng)由WspA～F和WspR等7個(gè)蛋白組成，分布在菌細(xì)胞膜上，組成了級(jí)聯(lián)感應(yīng)系統(tǒng)。這一感應(yīng)系統(tǒng)所感應(yīng)的信息最終傳遞到雙組分響應(yīng)調(diào)節(jié)子WspR，該蛋白的磷酸化將激活DGC活性并合成c-di-GMP，促進(jìn)胞外多糖合成。SadC是一種有DGC活性的膜蛋白，通過合成c-di-GMP促進(jìn)胞外Pel多糖的合成及BF形成，抑制菌體的Swarming運(yùn)動(dòng)。酶蛋白BifA具有PDE活性，降解c-di-GMP，增強(qiáng)菌體的Swarming運(yùn)動(dòng)而抑制BF形成或有利于其分解和散播。

2.4 sRNA調(diào)節(jié)系統(tǒng)

PA-BF的形成和發(fā)育還受非編碼小RNA（sRNA）等機(jī)制的調(diào)節(jié)。sRNA是一類長(zhǎng)度在50～500個(gè)核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌中的RNA，調(diào)控多個(gè)生理過程。徐鳳琴等研究了PA中sRNA系列的phrs，證明其在PA-BF形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 生物膜內(nèi)細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組及其對(duì)生物膜發(fā)育的影響

基因的水平轉(zhuǎn)移可在同種或不同菌種之間進(jìn)行，能使細(xì)菌在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生新的基因型個(gè)體，適應(yīng)環(huán)境的變化或產(chǎn)生廣泛的耐藥性。生物膜內(nèi)菌群密度大，細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移非常活躍，基因交換和重組的頻率很高?；虻乃睫D(zhuǎn)移方式有轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等。（1）轉(zhuǎn)化（Transformation）是在親緣關(guān)系較近的細(xì)菌DNA之間進(jìn)行的同源重組。BF菌群釋放和攝入DNA的頻率顯著，DNA的轉(zhuǎn)化率極大提高，促進(jìn)了BF菌群遺傳異質(zhì)性和生物多樣性的形成。（2）通過接合（Conjugation）形成的基因轉(zhuǎn)移主要在G-菌之間進(jìn)行。BF菌之間的質(zhì)粒接合率比游離狀態(tài)的大許多，攜帶耐藥、毒素、性菌毛等基因的質(zhì)粒能夠在細(xì)菌之間迅速傳播，使BF菌產(chǎn)生多重的抗藥性，毒素及性菌毛普遍生長(zhǎng)。性菌毛具有粘合不同菌細(xì)胞的作用，使BF結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）即以噬菌體為載體，將供體菌DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌并使之獲得新遺傳性狀的過程。G-菌和G+菌均可發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。一些噬菌體攜帶聚糖酶（Polysaccharide depolymerase）基因，產(chǎn)生的聚糖酶能分解胞外多糖及BF。噬菌體正在被研究用來(lái)防控BF的感染。

4 結(jié)語(yǔ)

PA作為研究細(xì)菌生物膜（BF）的模型，其BF胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成和生物學(xué)功能、BF形成和發(fā)育的顯微過程及其調(diào)控機(jī)制QS和c-di-GMP調(diào)節(jié)系統(tǒng)研究得較為詳盡，sRNA等調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究有了端倪。BF胞外多糖Psl、Pel和藻酸鹽合成的有關(guān)基因及其酶系只有零散的初步確認(rèn)，至于胞外多糖的三維結(jié)構(gòu)、合成代謝途經(jīng)涉及的酶和酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，則很少研究，這些都是今后PA及其他細(xì)菌BF的研究努力的方向。胞外多糖是形成BF的主要EPS，只有認(rèn)識(shí)了它的合成途徑和分子調(diào)控機(jī)制及其酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，才能夠有效地篩選和設(shè)計(jì)藥物，建立防治細(xì)菌BF感染的有效措施。