黑龍江省大白菜黑腐病病原菌的分離與鑒定

孟雪嬌 史慶馨 許春梅 馮一新 高永利 沙春艷 陳立新

摘? ? 要：十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種引起的世界性的重要病害之一。近年來，黑龍江省大白菜黑腐病增加，因此有必要對其進(jìn)行研究。以黑龍江省哈爾濱市和依蘭縣感染黑腐病的大白菜葉片為試材，分離純化病原菌，獲得3株病原菌。應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定病原菌，以細(xì)菌通用引物16S rRNA對該病原菌進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增測序分析，發(fā)現(xiàn)該病原菌均與Xanthomonas campestris pv. campestris 具有分別為99.71%、100.00%和99.93%的一致性。根據(jù)分離菌的表型特征及分子特征，鑒定分離的病原菌為大白菜黑腐病的致病菌-野油菜黃單胞菌野油菜致病變種。

關(guān)鍵詞：大白菜;黑腐病;野油菜黃單胞菌野油菜致病變種;黑龍江

中圖分類號：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）07-020-05

Isolation and identification of pathogenic bacteria of black rot in Chinese cabbage in Heilongjiang

MENG Xuejiao1，2， SHI Qingxin2， XU Chunmei2， FENG Yixin2， GAO Yongli2， SHA Chunyan2， CHEN Lixin2

（1. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme， Harbin 150086， Heilongjiang， China; 2. Horticultural Sub-academy， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）

Abstract： The black rot of cruciferous vegetable caused by Xanthomonas campestris pv. campestris is one of the most important diseases in the world. In recently years， the incidence of black rot of the chinese cabbage has increased in Heilongjiang Province， therefore， pathogen was isolated and identified. The leaves of Chinese cabbage infected by black rot were used as test materials in Yilan county and Haerbin city in Heilongjiang province. The pathogens were isolated and purified， and three pathogenic strains were obtained. The pathogenic bacterias were identified by molecular biological methods， their 16S rRNA were amplified by PCR with the universal primer 16S. It was found that the sequences of pathogens were 99.71%， 100.00%， and 99.93% consistent with that of Xanthomonas campestris pv. campestris， respectively. The isolated strain were identified as Xanthomonas campestris pv. campestris based on their phenotepic and molecular characteristics.

Key words： Chinese cabbage; Black rot; Xanthomonas campestris pv. campestris; Heilongjiang

黑腐病主要危害十字花科蔬菜葉片、葉球和球莖，十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pam.） Dowson]引起的世界性的重要病害之一[1]。黑腐病的寄主范圍相當(dāng)廣泛，主要危害甘藍(lán)[2-4]、結(jié)球白菜[3，5]、不結(jié)球白菜[3，5]等。大白菜幼苗期即可發(fā)病，但以成株發(fā)病為主。

由于氣候條件變化、多茬栽培和國外春大白菜品種的引進(jìn)，黑腐病對蔬菜生產(chǎn)的威脅日趨擴(kuò)大。20世紀(jì)80 年代全國各地已經(jīng)普遍流行，北起黑龍江、南至海南島均有分布，大白菜的產(chǎn)量受到很大損失，且品質(zhì)受到很大影響[6-8]。因此，黑腐病不僅是世界、也是我國大白菜的主要病害之一[9]。

國內(nèi)對黑腐病菌的研究主要有：蘆燕[8]對陜西省大白菜黑腐病病原菌及抗病性進(jìn)行鑒定;解永梅等[10-11]對山東省大白菜黑腐病的研究，分別在細(xì)胞和分子水平上完成了山東省地區(qū)的病原菌鑒定，完善了相對應(yīng)的抗病性鑒定方法研究，證明了存在致病型分化，并進(jìn)行了抗性資源的篩選等;鄭學(xué)立等[12]對福建地區(qū)不結(jié)球白菜黑腐病菌進(jìn)行分離與初步鑒定;翟文慧等[13]進(jìn)行了大白菜黑腐病鑒定的濕度試驗及其苗期與成株期抗病性的相關(guān)分析研究，發(fā)現(xiàn)苗期與成株期抗病性呈顯著線性關(guān)系，說明用苗期人工接種的方法鑒定大白菜黑腐病抗性是可靠的，可以縮短研究時間。其他十字花科蔬菜，如甘藍(lán)、青花菜、蘿卜等的黑腐病研究相對較多。如張玉勛等[14]對970份蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行了抗黑腐病鑒定，其中3份表現(xiàn)抗性強，867份皆表現(xiàn)不抗病;黃德芬等[15]對甘藍(lán)黑腐病離體鑒定方法進(jìn)行研究;曹建琴等[16]對15個甘藍(lán)品種進(jìn)行不同生育期抗黑腐病田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)對甘藍(lán)黑腐病進(jìn)行藥物防治應(yīng)重點選擇在蓮座期至收獲期;劉莉莉等[17]對青花菜黑腐病菌分離和鑒定;朱平川等[18]用剪葉接種法對廣西十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris， XCC）進(jìn)行致病性分析，并應(yīng)用細(xì)菌基因組的重復(fù)序列PCR （Rep-PCR）技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)侵染廣西十字花科黑腐病菌存在明顯的致病性分化和豐富的遺傳多樣性。

國外對黑腐病的研究相對較多，包括生理小種的劃分、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究等等。如2007年XCC被分為9個生理小種[19]，而到現(xiàn)在為止XCC被分為11個生理小種[20]。對十字花科黑腐病轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，prc基因，即XCC致病機制相關(guān)的特殊蛋白酶發(fā)生轉(zhuǎn)位子突變，引起毒性及胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低，RNA-Seq發(fā)現(xiàn)91個差異表達(dá)基因，這些基因主要參與碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜生成、翻譯后修飾、蛋白周轉(zhuǎn)和分子伴侶、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[21]。關(guān)于野油菜黃單胞菌野油菜致病變種與寄主甘藍(lán)（Brassica oleracea）易感品種內(nèi)源表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)的報道是在2008年，應(yīng)用雙向電泳結(jié)合肽指紋圖譜或從頭測序技術(shù)，對未來的研究分析非常有用，進(jìn)而發(fā)展為新策略來控制這個非常重要的植物病原體[22]。Santos等[23]應(yīng)用label-free shotgun 2D-nanoUPLC/MSE分析XCC蛋白與易感植物、抗性植物共生及培養(yǎng)基（對照）中情況，并應(yīng)用qPCR方法確定被選擇的一些基因的差異表達(dá)情況，主要研究病菌的致病性機制。

近幾年，筆者及所在單位科研工作者在田間調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，黑龍江省的大白菜黑腐病越來越嚴(yán)重，所以，迫切需要解決這個問題，有必要加強對其進(jìn)行研究[24]。在參照蘆燕[8]方法的基礎(chǔ)上，筆者通過采集大白菜黑腐病樣葉片，分離、純化并鑒定黑腐病菌，獲得黑腐病菌部分基因序列，為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黑腐病葉片2017年采集于黑龍江省依蘭縣農(nóng)民白菜地，2018年采集于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院試驗田，材料分別為586（哈爾濱劉元凱種業(yè)有限公司育成的品種）和龍園紅4號（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院育成的橘紅心品種）。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉 5 g，瓊脂粉20 g，純化水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 分別于2017年和2018年10月份在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院公共實驗室進(jìn)行病原菌的分離。2017年從黑龍江省依蘭縣和2018年從黑龍江省哈爾濱市采集大白菜黑腐病病樣，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行分離、純化。具體步驟如下：在操凈工作臺上，黑腐病葉片的病健交界處取5 mm×5 mm的葉片，用75%酒精浸泡15 s，重復(fù)1遍，之后再用無菌水沖洗1遍，最后，用無菌鑷子將沖洗過的葉片放在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，從培養(yǎng)皿上挑取細(xì)菌接到新培養(yǎng)基皿中（劃Z字形），待其恒溫培養(yǎng)，之后挑取單菌落，繼續(xù)進(jìn)行純化。

1.2.2 病原菌致病性測定 黑腐病菌經(jīng)活化后，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于空氣搖床內(nèi)28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，之后用小型噴壺用噴霧法接種到4～5葉期健康的大白菜葉片上[12]，26 ℃氣候培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)2 d，觀察其發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)測定 菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以12 000 r·min-1 離心，收集菌體，采取SDS方法提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由北京六合華大基因科技有限公司合成細(xì)菌通用引物16 s，用于擴(kuò)增。16 s引物序列：27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

PCR反應(yīng)體系：總體積30 μL，反應(yīng)液為DNA 模板 1 μL，引物各 3 μL，dNTP 2 μL，Buffer 3 μL，酶 0.2 μL，H2O 17.8 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將樣品送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對，用MEGA6.0軟件構(gòu)建Neighborhood-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑腐病病樣

黑腐病菌從大白菜葉緣的水孔侵入后先形成三角形褪綠黃斑，葉緣產(chǎn)生黃褐色壞死斑，再沿葉脈蔓延，逐漸擴(kuò)大成“V”字形或長條形黃褐斑，周邊伴有黃色褪綠暈帶，該部葉脈壞死變黑（圖1）。

2.2 病原菌的分離與純化

采用平板劃線法在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行病原菌的分離與純化。發(fā)現(xiàn)菌在牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基上初期呈淡黃色，后期變蠟黃色，形成黏稠狀近圓形菌落（圖2），共獲得3個菌株，分別為yian、harbin1、harbin2，其中2017年獲得1株，2018年獲得2株。

2.3 病原菌的致病性測定

將純化后的黑腐病菌于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大白菜葉片保濕48 h后接種黑腐病菌 48 h，發(fā)現(xiàn)3個菌株引起的癥狀與黑腐病均一致（圖3）。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4），經(jīng)測序分別得到長1417、1327、1396 bp堿基序列，經(jīng)NCBI BLAST （http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast） 網(wǎng)上比對，這3個菌株與已報道的野油菜葡萄球菌致病變種保守序列一致性分別為99.71%、100.00%和99.93%，證明分離純化的病原菌即為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種。并用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

3 討論與結(jié)論

因大白菜黑腐病的發(fā)病面積較以往逐漸增加，引起關(guān)注。筆者通過采集兩年黑龍江省大白菜黑腐病樣，獲得了黑龍江省部分地區(qū)的大白菜黑腐病菌序列，序列比對結(jié)果說明分離純化的黑腐病菌均為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種，確定引起黑龍江省大白菜黑腐病的病原菌均為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種，與盧燕[8]研究結(jié)果相同，說明野油菜黃單胞菌野油菜致病變種引發(fā)了大白菜黑腐病。

2017年，Cruz等[20]將XCC劃分為11個生理小種。近幾年，基于參考基因組開發(fā)的特異性生理小種標(biāo)記研究也已開展，2018年，首次報道開發(fā)了3個關(guān)于Xcc race3的標(biāo)記XccR3-49、XccR3-52和XccR3-55[25]，且在2017年，同研究組也報道了關(guān)于Xcc race1和Xcc race4的分子標(biāo)記[26]，這些為快速檢測和鑒定黑腐病菌提供了分子生物學(xué)手段。筆者在本研究中分離了3株黑腐病菌，黑龍江省地區(qū)黑腐病是否還有其他致病型，還有待于繼續(xù)研究，且可以借助特異性生理小種標(biāo)記技術(shù)快速檢測黑腐病菌。

本試驗為以后的研究奠定了基礎(chǔ)，筆者將不斷深入對大白菜黑腐病的研究，如應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)分析大白菜抗黑腐病的可能機制，為科學(xué)鑒定抗黑腐病種質(zhì)資源提供依據(jù)及快速準(zhǔn)確的實驗手段，同時對縮短抗性品種的選育時間、推動抗黑腐病育種進(jìn)程等具有重要的科學(xué)意義。從生態(tài)、效益等方面考慮，選育抗性品種并加以利用，減少黑腐病發(fā)病面積，會減少農(nóng)藥的使用，減輕農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞;另一方面，會減少資金投入，因此，可帶來更多的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

參考文獻(xiàn)

[1] WILLIAMS P H，STAUB T，SUTTON J C.Inheritance of resistance in cabbage to black rot[J].Phytopathology，1972，62（2）： 247-252.

[2] 肖崇剛.一種甘藍(lán)黑腐病接種新方法[J].植物保護(hù)，1994（5）：35-36.

[3] 李永鎬，徐麗波.甘藍(lán)黑腐病苗期抗病性鑒定方法的研究[J].東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1990，21（2）：125-129.

[4] 程伯瑛，武永慧，王翠仙，等.惠豐甘藍(lán)對黑腐病的抗性鑒定研究[J].北方園藝，2002（6）：48-49.

[5] 吳國順.日本對幾種蔬菜病害抗病性鑒定方法的研究[J].中國蔬菜，1994（1）：59-60.

[6] 李經(jīng)略.十字花科蔬菜黑腐病的調(diào)查研究[M]//陜西植物保護(hù)研究所. 植物保護(hù)研究. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[7] 李明遠(yuǎn).我國北方大白菜病害現(xiàn)狀及發(fā)展的淺見[J].中國蔬菜，1993（4）：38-40.

[8] 蘆燕.大白菜黑腐病病原菌鑒定和抗病性鑒定方法研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[9] 方智遠(yuǎn)，李經(jīng)略.甘藍(lán)抗病育種研究進(jìn)展[M]//李樹德.中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展.北京：科學(xué)出版社，1995：583- 584.

[10] 解永梅，張成玲，趙永強，等.山東省大白菜黑腐病病原的鑒定及其生物學(xué)特性的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：68-70.

[11] 解永梅.山東省十字花科蔬菜黑腐病菌的鑒定及大白菜品種抗病性研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[12] 鄭學(xué)立，謝鑫鑫，林峰，等.福建地區(qū)不結(jié)球白菜黑腐病病原菌的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，32（12）：1335-1340.

[13] 翟文慧，張濤濤，胡俊，等.大白菜黑腐病鑒定的濕度試驗及其苗期與成株期抗病性的相關(guān)分析[J].中國蔬菜，2010（10）：59-63.

[14] 張玉勛，曲士松，黃寶勇，等.蘿卜種質(zhì)資源抗黑腐病鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（6）：33-34.

[15] 黃德芬，李成瓊，司軍，等.甘藍(lán)抗黑腐病離體鑒定方法的研究[J].西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，33（8）：5-9.

[16] 曹建琴，王靜，顧蓉.甘藍(lán)品種黑腐病抗性試驗[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（7）：1153-1156.

[17] 劉莉莉，文正華，單曉政，等.青花菜黑腐病致病菌的分離和鑒定[J].中國瓜菜，2018，31（7）：18-22.

[18] 朱平川，盧潔，張昭穎，等.廣西十字花科黑腐病菌致病性分化及遺傳多樣性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（3）：541-547.

[19] FARGIER E， MANCEAU C.Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. campestris[J].Plant Pathology，2007，56 （5）：805-818.

[20] CRUZ J，TENREIRO R，CRUZ L.Assessment of diversity of Xanthomonas campestris pathovars affecting cruciferous plants in Portugal and disclosure of two novel X. campestris pv. campestris races[J].Journal of Plant Pathology，2017，99（2）：403-414.

[21] LIAO C T， LIU Y F， CHIANG Y C， et al.Functional characterization and transcriptome analysis reveal multiple roles for prc in the pathogenicity of the black rot pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris[J].Research in Microbiology，2016，167（4）：299-312.

[22] ANDRADE A E，SILVA L P，PEREIRA J L，et al.In vivo proteome analysis of Xanthomonas campestris pv. campestris in the interaction with the host plant Brassica oleracea[J].FEMS Microbiology Letters，2008，281（2）：167-174.

[23] SANTOS C，MAXIMIANO M R，RIBEIRO D G，et al.Differential accumulation of Xanthomonas campestris pv. campestris proteins during the interaction with the host plant：Contributions of an in vivo system[J].Proteomics，2017，17（12）：1700086.

[24] 孟雪嬌，史慶馨，陳立新.大白菜黑腐病研究進(jìn)展[J].中國瓜菜，2019，32（4）：8-11.

[25] AFRIN K S，RAHIM M A，RUBEL M H，et al.Development of race-specific molecular marker for Xanthomonas campestris pv. campestris race 3，the causal agent of black rot of crucifers[J].Canadian Journal of Plant Science，2018，98（5）：1119-1125.

[26] RUBEL M H， ROBIN A H K， NATARAJAN S， et al.Whole-genome re-alignment facilitates development of specific molecular markers for races 1 and 4 of Xanthomonas campestris pv. campestris，the cause of black rot disease in Brassica oleracea[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（12）：2523.