哮喘患兒呼吸道病毒感染特征及其與α-干擾素治療前后Th1、Th2細胞因子平衡的相關性研究

吳建剛 陳玉梅 陳美元 沈燕 黃麗珍（蘇州市第九人民醫(yī)院兒科，蘇州215200）

哮喘是一種以喘息、咳嗽、胸悶為主的慢性氣道炎癥，哮喘發(fā)病率高，特別是兒童患者發(fā)病率逐年上升。研究表明，國內每十年哮喘患兒的發(fā)病率升高20%~50%，這消耗了巨大的醫(yī)療資源，嚴重影響了患兒的身心健康［1］。過去一直認為過敏是導致哮喘的主要因素；近年來研究發(fā)現，病毒可能是引起兒童哮喘急性發(fā)作的重要病原體，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、鼻病毒（rhinovirus，RV）、腺病毒（adenovirus，ADV）、流感病毒（influenza，IF）、副流感病毒（parainfluenza vi?rus，HPIV）、腸病毒（enterovirus，EV）、人偏肺病毒（human meta lung virus，hMPV）、博卡病毒（Boka vi?rus，BOCA）等［2］，但目前關于哮喘兒童呼吸道相關病毒感染特征的研究還較少?；純涸诟腥静《竞螅瑱C體產生T細胞活化觸發(fā)相關免疫反應，T細胞活化后被分化成Th1和Th2細胞，分別分泌對應的Th1型細胞因子和Th2型細胞因子，分別促進Th1型免疫反應和Th2型免疫反應。目前臨床已有研究證實，哮喘急性發(fā)作及其進程與其體內Th1/Th2型免疫失衡密切相關［3］。干擾素是一種光譜抗病毒制劑，可以通過作用于細胞表面受體產生抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用。本研究擬分析哮喘兒童病毒感染的特征，并探討其在經過干擾素治療后體內的Th1/Th2型細胞因子平衡的變化及其相關性，以期為臨床治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料本研究為前瞻性研究，選擇2017年1月至2020年1月在我院就診的220例哮喘患兒和同期的100例健康兒童為研究對象。對所有研究對象進行病原體檢查，并進一步納入其中的病毒性哮喘患兒進行干擾素治療。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 納入標準①年齡<14歲；②臨床癥狀主要為突然發(fā)生喘息、氣促、咳嗽、胸悶等，符合支氣管哮喘相關診斷標準［4］；③急性發(fā)作期；④發(fā)病時間72 h內；⑤獲得患兒監(jiān)護人知情同意書。

1.1.3 排除標準①排除肝腎功能不全者；②哮喘慢性持續(xù)期及臨床緩解期；③合并其他先天性肺部疾病以及氣道畸形等呼吸系統(tǒng)疾??；④就診前2周內使用過免疫制劑者。

1.1.4 藥品與試劑布地奈德混懸液（普米克令舒，批準文號：H20140475，2 ml）；異丙托溴銨溶液（愛全樂，批準文號：H20150159，500 μg∶2 ml）；重組人干擾素α-2b注射液（北京凱因科技股份有限公司提供，批準文號201601018，3 mU/0.3 ml）；RTPCR檢測試劑盒購自江萊生物；Th1、Th2檢測試劑盒購自美國BD公司；流式細胞儀（賽默飛Attune NxT流式細胞儀）；ELISA檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及治療納入病毒檢測為陽性的患兒進一步研究，根據隨機數字表法分為對照組和觀察組，其余患兒進行常規(guī)對癥處理。病毒感染患兒首先進行止咳、平喘、祛痰常規(guī)治療，對照組進行布地奈德混懸液、異丙托溴銨溶液霧化治療，觀察組在此基礎上增加1.2 ml重組人干擾素α-2b注射液霧化治療，2次/d，連續(xù)治療7 d，觀察不良反應。分別于就診當日和治療7 d后采用肺功能儀檢測患兒肺功能，包括第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in first second，FEV1）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）及用力肺活量（forced vital ca?pacity，FVC）。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 病毒檢測采集所有受試者的鼻咽拭子，使用2 ml樣本保存液斡旋離心后取上清進行病毒檢測。病毒檢測操作采用熒光定量RT-PCR，檢測的病毒包RSV、RV、ADV、IF、HPIV、EV、hMPV、Boka virus、BOCA等，所有操作嚴格按照說明書進行，結果根據熒光信號曲線進行判定，以Ct值>40為陰性，≤40為陽性。

1.2.2.2 肺功能指標檢測分別于就診當日和治療7 d后采用肺功能儀檢測患兒肺功能，包括FEV1、PEF及FVC。

1.2.2.3 炎癥因子檢測分別于就診當日和治療7 d后采集外周靜脈血3 ml兩份其中一份置于抗凝管中，采用流式細胞儀檢測Th1、Th2水平；另一份3 000 r/min離心取上清，檢測Th1、Th2型細胞因子的水平，具體如下：①Th1、Th2檢測：樣本于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4~6 h，分別加入10 μl CD4-PC7和CD3-PC5，室溫避光孵育15 min，加入3 ml緩沖液，混勻，離心，留下層沉淀，加入100μl破膜劑，分別加入10 μl IFN-γ-FITC熒光抗體和IL-4-PE單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，緩沖液重懸后上流式細胞儀檢測，獲得只分泌IFN-γ和IL-4的CD4+細胞，分別代表Th1細胞和Th2細胞，并計算其比值。②Th1、Th2型細胞因子檢測：采用ELISA法檢測外周血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平，所有操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法所有數據采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料采用百分比表示，卡方檢驗，計量資料的采用±s表示，多組比較采用F檢驗，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 哮喘患兒病毒感染特征220例患兒中有164例病毒陽性，陽性率74.55%。其中RSV（82/220，37.27%）、RV（65/220，29.55%）、ADV（19/220，8.64%）、IF（27/220，12.27%）、HPIV（30/220，13.64%）、EV（38/220，17.27%）、hMPV（10/220，4.55%）、Boka virus（12/220，5.45%）、BOCA（8/220，3.64%）。其中122例為單一病毒感染，42例為混合感染。其中不同季節(jié)的病毒陽性率為：春季38/54（70.37%）、夏 季17/30（56.67%）、秋 季33/48（68.75%）、冬季76/88（86.36%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.881，P=0.004），冬季陽性率顯著高于其他3個季節(jié)。

220例患兒根據病情嚴重程度分為輕度（96例）、中度（80例）、重度（44例）3個亞組，比較3個亞組病毒感染情況，單個病毒感染上3組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但中度組和重度組病毒總陽性率顯著高于輕度組（P<0.05），詳見表1。

表1 輕、中、重組哮喘患兒病毒感染情況［例（%）］Tab.1 Viral infection in children with mild，moderate and severe asthma［n（%）］

2.2 肺功能比較健康組兒童男52例，女48例，年齡3~12歲，平均（6.72±1.16）歲。164例病毒陽性患兒隨機分為對照組（82例）和觀察組（82例）；其中對照組患兒男45例，女37例，年齡3~12歲，平均（7.10±1.24）歲，輕度17例，中度28例，重度37例；觀察組男48例，女34例，年齡3~12歲，平均（7.23±1.05）歲，輕度14例，中度22例，重度46例。3組性別和年齡差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），對照組和觀察組病情嚴重程度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。對照組、觀察組FEV1%、PEF%、FVC%治療前無顯著差異（P>0.05），但顯著低于健康組（P<0.05）；治療后，對照組和觀察組FEV1%、PEF%、FVC%顯著升高（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組無顯著差異（P>0.05），但觀察組顯著高于對照組（P<0.05），詳見表2。

表2 治療前后肺功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment（±s）

表2 治療前后肺功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes before and after treatment（±s）

Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

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2.3 Th細胞比較對照組、觀察組Th1%、Th2%、Th1/Th2治療前無顯著差異（P>0.05），但Th1%、Th1/Th2顯著低于健康組（P<0.05），Th2%顯著高于健康組（P<0.05）；治療后，對照組和觀察組Th1%、Th1/Th2顯著 升 高、Th2%顯著 下 降（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組無顯著差異（P>0.05），但觀察組Th1%、Th1/Th2顯著高于對照組（P<0.05），Th2%顯著低于對照組（P<0.05），詳見表3。2.4 Th細胞因子比較對照組、觀察組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6治療前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但

表3 治療前后Th1、Th2細胞比較（±s）Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment（±s）

表3 治療前后Th1、Th2細胞比較（±s）Tab.3 Comparison of Th1 and Th2 cells before and after treatment（±s）

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Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

IL-2、IFN-γ顯著低于健康組，IL-4、IL-6顯著高于健康組（P<0.05）；治療后，對照組和觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高，IL-4、IL-6顯著下降（P<0.05），組間比較，觀察組和健康組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但觀察組IL-2、IFN-γ顯著高于對照組（P<0.05），IL-4、IL-6顯著低于對照組（P<0.05）；詳見表4。

表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6 before and after treatment（±s）

表4 治療前后IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6 before and after treatment（±s）

Note：Compared with Healthy group，1）P<0.05；compared with before treatment，2）P<0.05；compared with control group after treatment，3）P<0.05.

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2.5 肺功能與Th1/Th2的相關性研究將164例患兒治療前后的FEV1%、PEF%、FVC%與治療前后的Th1、Th2、Th1/Th2納入Pearson相關性研究，結果發(fā)現FEV1%與Th1呈正相關（P<0.05）、與Th2呈負相關（P<0.05），FEV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2均呈正相關（P<0.05）；詳見表5。

表5 FEV1%、PEF%、FVC%與Th1、Th2、Th1/Th2的相關性Tab.5 Correlation between FEV1%，PEF%，FVC% and Th1，Th2，Th1/Th2

2.6 不良反應治療期間，未發(fā)生嚴重不良反應。

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎癥，臨床癥狀以反復喘息、氣促、胸悶和咳嗽為主。一項收集2015年1月至2019年3月的484 719例兒童Meta分析表明，中國兒童哮喘平均患病率為4.90%，進一步亞組分析表明發(fā)病率逐年升高，由3.8%上升6.5%［5］。哮喘嚴重影響兒童的生長發(fā)育健康，帶來了巨大的醫(yī)療負擔。近年來，現代醫(yī)學研究發(fā)現，病毒感染可能是導致哮喘發(fā)病的主要原因之一。患兒支氣管壁在感染病毒后，發(fā)生炎性改變，形成炎癥浸潤，氣道表現出高反應性，即支氣管壁黏膜發(fā)生水腫，分泌物不斷增加，逐漸導致氣管痙攣、氣流受限，表現出咳嗽、喘息等臨床癥狀［6］。與此同時，體內的免疫系統(tǒng)啟動，氣管內的嗜酸性粒細胞升高，釋放炎癥因子和過敏介質，擴大炎癥反應，殺滅病原菌的同時也會損傷氣管組織，加劇氣道高反應性和喘息癥狀［7］。

病毒作為可能是誘發(fā)哮喘急性發(fā)作的重要原因，但具有一定的地域性差異。能誘導急性哮喘的病毒種類眾多，本研究對在我院就診的220例哮喘患兒進行病毒篩查檢測，發(fā)現74.54%伴有單一或多重病毒感染，其中以RSV和RV的感染率最高，分別為37.27%、29.55%，RSV和RV是被報道的最常見單位兩種導致呼吸道疾病的病毒［8］。王婷等［9］對喘息發(fā)作期哮喘嬰幼兒的病毒原檢測中發(fā)現，鼻咽部標本病毒陽性率為49.6%；盧可斌等［10］對菏澤115例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的調查發(fā)現病毒感染率為67.83%，說明病毒感染在哮喘中不可小覷。分別對季節(jié)和嚴重程度進行分析以后發(fā)現冬季是病毒感染的高發(fā)季節(jié)，而春夏秋感染率較低，這與病毒本身單鏈RNA不耐熱的特征有關，提示哮喘病毒感染具有一定的季節(jié)流行性。分析病毒感染與病情的特征發(fā)現，中重度患兒病毒感染率顯著高于輕度患兒，這與孫遜等［11］報道的RSV和PIV感染與哮喘中重度哮喘急性發(fā)作有關具有相似性，說明病毒感染可能是導致病情加重的原因。這可能與病毒感染會影響機體的免疫平衡，加重氣道炎癥相關。

目前臨床已經達成共識，認為嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等多種細胞及其分泌的細胞因子共同參與了哮喘的整個發(fā)病過程，但是單純地針對過敏機制以及減輕氣道反應癥狀的常規(guī)治療仍然無法完全控制患兒的病情，特別是伴有病毒感染的重癥患兒。病毒感染與哮喘的病情進展的關系已經獲得了臨床大多數學者的認可［12］，因此，本研究進一步對病毒感染的患兒進行α-干擾素抗病毒治療，結果發(fā)現治療1周后觀察組肺功能顯著改善且優(yōu)于對照組，FEV1%、PEF%、FVC%與健康組兒童比較無顯著差異，說明α-干擾素通過霧化吸入能顯著改善急性發(fā)作哮喘患兒的臨床癥狀。顧霞等［13］使用IFN-γ治療支氣管哮喘，發(fā)現能提高臨床有效率、改善肺功能。分析認為霧化吸入能有效提高病灶局部藥物有效濃度，針對氣道炎癥進行快速干預，同時有效減輕全身副作用。α-干擾素是一種能作用于細胞表面受體的活性蛋白質，具有廣譜的抗病毒作用，其機制主要是通過與細胞膜表面受體結合產生抗病毒蛋白發(fā)揮抑制蛋白復制、擴增作用，已經被應用于多種病毒感染的相關治療［14］。此外，α-干擾素還可以調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，可以通過調節(jié)機體T淋巴細胞亞群的平衡來間接發(fā)揮免疫增強作用［15］。

目前，已有相關研究證實哮喘患兒存在T細胞介導的免疫功能紊亂現象，T細胞介導的細胞免疫是機體清除病毒感染的重要機制［16］。T細胞分為Th1和Th2，Th1主要通過產生IL-2、IFN-γ來減輕免疫炎癥、緩解臨床癥狀，Th2主要通過產生IL-4、IL-6發(fā)揮免疫促進、加重炎癥反應作用。本研究結果發(fā)現，與健康組比較，治療前兩組患兒的Th1%降低、Th2%升高，Th1/Th2偏低，提示病毒感染的哮喘患兒存在T細胞免疫向Th2偏移現象。在治療1周后，觀察組Th1/Th2顯著高于對照組，并接近健康組水平，說明α-干擾素干預能調節(jié)機體的Th1、Th2免疫平衡。同時，我們分別觀察了Th1和Th2分泌的代表性細胞因子，發(fā)現其規(guī)律與Th細胞類似，治療前，兩組患兒IL-2、IFN-γ顯著低于健康組，IL-4、IL-6顯著高于健康組，治療后觀察組IL-2、IFN-γ顯著升高，IL-4、IL-6顯著下降，且與健康組比較均無顯著差異，提示α-干擾素治療有利于調節(jié)Th1和Th2分米的細胞因子的平衡，這些可能是支持α-干擾素能調節(jié)哮喘患兒免疫平衡的證據之一。機體在感染病毒后，Th1細胞產生IL-2、IFN-γ，有助于減輕炎癥反應，其中IFN-γ又可以進一步促進T細胞分化成Th1細胞，發(fā)揮免疫炎癥抑制作用，減輕對氣管壁正常組織的損傷［17］。Th2細胞產生的IL-4和IL-6參與嗜酸性粒細胞的免疫放大炎癥反應，這些細胞因子可以招募更多的炎癥因子，加重放大炎癥反應，并抑制Th1型炎癥保護作用，促進T細胞免疫平衡向Th2偏移［18］。臨床也有相關報道認為病毒感染的呼吸道病毒中，免疫應答方式以Th2為優(yōu)勢應答，并以Th1/Th2的平衡狀態(tài)來衡量疾病的嚴重程度［19］。本研究中進一步的相關性分析也有類似發(fā)現：FEV1%與Th1呈正相關（P<0.05）、與Th2呈負相關（P<0.05），FEV1%、PEF%、FVC%與Th1/Th2比值均呈正相關（P<0.05），這也進一步說明哮喘患兒的肺功能與Th1/Th2有密切相關性，α-干擾素的抗病毒和免疫調節(jié)作用能有利于改善肺功能以及Th1/Th2平衡。

綜上所述，急性哮喘病毒感染率高，采用α-干擾素進行抗病毒治療有利于改善患兒肺功能，調節(jié)Th1/Th2細胞平衡以及其對應的細胞因子平衡。