磷酸鹽和鈣的添加對(duì)Bacillus C075礦化重金屬Pb的影響

湯 鼎， 王 暉， 姜 毅， 趙興青

常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院， 江蘇 常州 213164

鉛(Pb)因具有熔點(diǎn)低、延展性好、耐蝕性強(qiáng)等獨(dú)特性能，已被廣泛用于鉛汽油、汽車、鉛酸電池等領(lǐng)域中[1]. 同時(shí)由于人類活動(dòng)的增加，如采礦、電池制造、汽油消耗以及有色金屬的開采等，在過去5年中，全球有超過80×104t的Pb被釋放到環(huán)境中[2-3]. 重金屬Pb具有難降解性和長(zhǎng)期持久性，可通過食物鏈對(duì)人類的生理健康造成嚴(yán)重威脅[4]. 人體中的痕量Pb會(huì)損害器官、智力、骨骼發(fā)育、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)等功能[5-7],因此Pb污染的治理迫在眉睫. 目前土壤中修復(fù)Pb的途徑主要有物理法、化學(xué)法和生物法. 但是傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法(如化學(xué)沉淀、離子交換和吸附等)都有其局限性，包括去除率低、成本高、操作復(fù)雜、對(duì)土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)造成影響以及產(chǎn)生其他有毒物質(zhì)等[8-9]. 微生物因其生物選擇性好、無毒和無二次污染等特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是一種成本低、前景好的新技術(shù)[10-12].

在生物修復(fù)技術(shù)中，微生物誘導(dǎo)的P礦化是一種新型土壤修復(fù)方法. 在P礦化過程中，通過添加P，微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(如磷酸酶)可以增加P的利用率，然后介導(dǎo)有毒離子礦化[13-15]. 通過P(如磷粉或磷灰石)對(duì)土壤進(jìn)行處理后可以增強(qiáng)焦晶石〔Pyro[Pb5(PO4)3X (X為Cl、F、OH)]〕的形成，并且該礦化物的溶解度(Ksp，10-85～10-60)極低，因此以焦晶石形式存在的Pb對(duì)環(huán)境的危害極低，在土壤修復(fù)礦化方面極為有利[16-17].

近年來，國(guó)內(nèi)外在微生物礦化重金屬方面開展了一系列研究. Macaskie等[18]發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌Citrobactersp.可通過磷酸化產(chǎn)生大量磷酸氫根離子，并在細(xì)胞表面形成礦物質(zhì)以從溶液中去除重金屬鎘(Cd)，其去除率可達(dá)到65%. Jin等[19]發(fā)現(xiàn)進(jìn)行P增溶處理的Enterobactersp.可通過將Pb固定為不溶性的磷酸鉛礦物質(zhì)來抵抗Pb. Ryan等[20]用羥基磷灰石對(duì)土壤進(jìn)行改良，孵育240 d后通過擴(kuò)展的X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)(EXAFS)的光譜發(fā)現(xiàn)，土壤中Pb的平均局部分子鍵和環(huán)境發(fā)生變化，并顯示出化學(xué)提取物與焦晶石的高度相似性，表明P的加入可將土壤中的Pb轉(zhuǎn)化為焦晶石. 然而，目前關(guān)于利用微生物礦化處理重金屬Pb污染的研究大多集中在通過微生物本身處理Pb污染方面，并且處理效率低且修復(fù)過程緩慢，而忽視了加入其他物質(zhì)(如P和Ca)提高修復(fù)效率的可能性.

因此，進(jìn)一步探討提高微生物修復(fù)土壤中Pb的效率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義. 在利用微生物修復(fù)重金屬Pb的過程中，加入P可以有效提高其對(duì)Pb的礦化效率. 在Pb污染的土壤中同時(shí)加入P和Ca可以進(jìn)一步促進(jìn)Pb有效性的降低，原因可能是降低了重金屬對(duì)微生物的毒害作用，以及形成了某種新的礦化物并且增加了更多吸附位點(diǎn)，進(jìn)而降低了土壤中Pb的有效性[21].

該研究利用從安徽銅陵獅子山礦區(qū)周邊重金屬污染土壤中篩選出的一株對(duì)Pb耐受的菌株BacillusC075，在進(jìn)行微生物礦化重金屬的試驗(yàn)中加入P和Ca，研究P和Ca對(duì)微生物和重金屬Pb礦化率的影響. 通過添加P和Ca分析微生物礦化重金屬Pb的最佳c(Ca2+)，通過動(dòng)力學(xué)曲線、FT-IR和XRD分析酶和官能團(tuán)對(duì)菌株礦化Pb的影響以及礦化物的主要成分，根據(jù)SEM-EDS和BET分析菌株和礦化物的形貌結(jié)構(gòu)以及礦化過程中菌株表面產(chǎn)生的變化，進(jìn)而深入了解P和Ca在微生物礦化Pb的過程中作用及其重要性，以期為更加有效去除土壤中的重金屬Pb提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株篩選及培養(yǎng)

選用菌株是從安徽銅陵獅子山礦區(qū)周圍重金屬污染土壤中分離出來的一株耐Pb芽孢桿菌，其編號(hào)為BacillusC075 (GenBank登錄號(hào)為MK907784). 將該菌株接種到LB培養(yǎng)基(魚粉蛋白胨濃度為10 g/L，NaCl濃度為5 g/L，酵母浸膏濃度為5 g/L)中，并置于37 ℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng).

1.2 P和Ca的添加對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

一般情況下，BacillusC075能將Pb礦化成礦化物沉淀Pb5(PO4)3OH，由該礦化物的化學(xué)分子式可知，Pb和P的分子比為5∶3，在該礦化試驗(yàn)中所用母液為c〔Pb(NO3)2〕=10 mmol/L和c〔Ca(NO3)2〕=100 mmol/L的溶液，分析P對(duì)微生物的影響試驗(yàn)中所用母液是c(KH2PO4)為6 mmol/L和c〔Ca(NO3)2〕分別為10、50、100、200、500 mmol/L的溶液. 將試驗(yàn)分為2組，每組均設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn). 在2組含有pH為7.0的75 mL LB培養(yǎng)基中分別加入KH2PO4溶液10 mL〔c(P)為0.6 mmol/L〕和無菌水10 mL，最后均加入OD600=1.0 nm的菌株溶液5 mL. 將樣品置于37 ℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24 h，并每隔3 h取1 mL菌液用分光光度計(jì)測(cè)其OD600值，以此確定P對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響.

為了探討不同c(Ca2+)下細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，在含有pH為7.0的75 mL LB培養(yǎng)基中分別加入KH2PO4和Ca(NO3)2溶液10 mL，設(shè)置體系c(P)為0.6 mmol/L，c〔Ca(NO3)2〕分別為0、1、5、10、20、50 mmol/L，且在每組錐形瓶中接種OD600=1.0 nm的菌株溶液5 mL，無菌水定容至100 mL(每組均設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)). 將樣品于37 ℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，并每隔3 h取一次樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD600值，通過c(Ca2+)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響情況確定最佳的c(Ca2+).

1.3 Ca的添加對(duì)細(xì)菌耐受性的影響

基于1.2節(jié)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)置體系c(Ca2+)為10 mmol/L. 將試驗(yàn)分為3組(每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù))，加菌組中每錐形瓶含有65 mL LB培養(yǎng)基均加入OD600=1.0的菌株溶液5 mL，菌+Pb組加入Pb(NO3)2溶液10 mL〔c(Pb2+)為1 mmol/L〕，菌+Pb+Ca組加入Pb(NO3)2溶液10 mL〔c(Pb2+)為1 mmol/L〕和Ca(NO3)2溶液10 mL〔c(Ca2+)為10 mmol/L〕，所有反應(yīng)組用無菌水定容至100 mL. 將3組樣品置于37 ℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取一次樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD600值，通過菌株的生長(zhǎng)量確定Ca添加對(duì)細(xì)菌Pb耐受性的影響.

1.4 P和Ca的添加對(duì)Pb2+礦化的影響

將礦化試驗(yàn)分為4組(每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù))，加菌組中每錐形瓶含有65 mL LB培養(yǎng)基均加入OD600=1.0的菌株溶液5 mL和Pb(NO3)2溶液10 mL〔c(Pb2+)為1 mmol/L〕，菌+Pb+P組加入KH2PO4溶液10 mL〔c(P)為0.6 mmol/L〕，菌+Pb+P+Ca組加入KH2PO4溶液10 mL〔c(P)為0.6 mmol/L〕和Ca(NO3)2溶液10 mL〔c(Ca2+)為10 mmol/L〕，空白對(duì)照組為不接菌的Pb(NO3)2溶液+LB體系，所有反應(yīng)組均用無菌水定容至100mL. 將這4組樣品置于搖床中，在37 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h，觀察其沉淀情況，離心后取其上清液，用火焰原子吸收光譜法測(cè)其Pb2+的濃度.

1.5 菌株礦化Pb的動(dòng)力學(xué)曲線

配制c(Pb2+)分別為10、20、50、100、200 mg/L的重金屬溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0，分別向其中加入5 mL的菌液，在37 ℃下水浴加熱. 反應(yīng)2 h后測(cè)定上清液中殘留的c(Pb2+)，計(jì)算反應(yīng)初速率V0，繪制1/V0-1/c(Pb2+)曲線，并計(jì)算最大酶促反應(yīng)速率(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)[22].

1.6 FT-IR及XRD分析

將干燥的樣品研磨后，以樣品與溴化鉀(光譜純)以體積比1∶100混合進(jìn)行壓片，在10 t/cm2下靜壓2 min. 采用Perkin-Elmer-Spectrum One型傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolt A vatar 370，美國(guó)尼高力儀器公司)收集波長(zhǎng)范圍為 4 000～500 cm-1處的紅外光譜數(shù)據(jù)，且其掃描準(zhǔn)確度為4 cm-1[23].

利用D-MAX2500型X-射線衍射儀(XRD，日本理學(xué)株式會(huì)社)對(duì)沉淀物的礦物成分進(jìn)行測(cè)定. 制樣方法同上，樣品充分干燥后研磨至300目(48 μm)，即可上機(jī)測(cè)定. 試驗(yàn)條件：電壓40 kV，管電流100 mA，CuKα=1.540 56 ?，掃描角度(2θ)為5°～80°，誤差小于0.02°，在0.02°/(0.2 s)條件下收集數(shù)據(jù)[24]. 所得結(jié)果用MDI Jade 5和Origin 8.0分析軟件進(jìn)行編輯處理.

1.7 SEM-EDS和BET分析

采用將離心(8 000 r/min，5 min)收集到的沉淀物先用2.5%戊二醛固定液固定1.5 h，離心后的沉淀再用乙醇按30%、50%、70%、90%、100%的梯度分別脫水15～20 min，將干燥后的樣品研磨后噴金后即可上機(jī). 試驗(yàn)用樣品在穩(wěn)定電壓15 kV的條件下，利用JSM-6360 LA型掃描電子顯微鏡&能譜儀(SEM & EDS，日本電子株式會(huì)社)對(duì)礦物沉淀的結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行觀察，并且利用EDS對(duì)礦物沉淀成分進(jìn)行詳細(xì)的元素分析. 最后再利用介孔材料比表面積及孔徑分析儀(BET ASAP2020，美國(guó)康塔儀器公司)對(duì)礦化物的比表面積、孔徑和吸附能力進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 P和Ca的添加對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

P和Ca的添加對(duì)BacillusC075的影響如圖1所示. 圖1(a)表明，有、無P添加對(duì)BacillusC075的生長(zhǎng)過程以及進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間基本一致，其生長(zhǎng)量變化也極小，進(jìn)一步證明當(dāng)添加c(P)為0.6 mmol/L時(shí)對(duì)BacillusC075的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用. 李文飛等[25]以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為培養(yǎng)對(duì)象，并通過在培養(yǎng)基中不添加P和添加P來分析P對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果是添加P的菌株具有更大的生長(zhǎng)直徑和更高的OD值. 這說明P對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有抑制作用，與試驗(yàn)結(jié)果一致.

圖1 P和Ca添加對(duì)Bacillus C075菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of P and Ca addition on strain Bacillus C075

由圖1(b)可見，添加c〔Ca(NO3)2〕為0、1、5、10、20、50 mmol/L的一系列試驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)過程趨勢(shì)一致，但是加Ca組的細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間比不加Ca組的要短，并快速進(jìn)行分裂繁殖，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，加Ca組比不加Ca組的OD600值要高. 從圖1(b)也可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著c(Ca2+)增加，細(xì)菌濃度也隨之增加，且在c(Ca2+)為10 mmol/L時(shí)細(xì)菌濃度最高，但是當(dāng)c(Ca2+)繼續(xù)增至50 mmol/L時(shí)，Ca2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)存在明顯的抑制效果. Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)，添加Ca2+可以有效降低重金屬對(duì)Bacillussp. T124的毒害作用，從而使得菌株活性增加，這是因?yàn)镃a2+能夠結(jié)合部分重金屬?gòu)亩档椭亟饘僭诃h(huán)境中的濃度. Bhattacharya等[27]發(fā)現(xiàn)，加入Ca2+后，粘液鏈球菌(Streptococcusmarcescens)和陰溝腸桿菌EMB19(EnterobactercloacaeEMB19)的活性明顯提高，并且對(duì)重金屬的去除率更高. 王新花等[28]利用施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)誘導(dǎo)碳酸鈣共沉淀對(duì)Pb進(jìn)行修復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)量會(huì)隨著c(Ca2+)的提高表現(xiàn)為先增后減，表明存在一個(gè)最佳Ca2+投加量. 在各種濃度Cd2+脅迫下，添加一定量的Ca2+能促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，當(dāng)c(Ca2+)為10 mmol/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)量最高，表明Ca2+和K+對(duì)Cd2+的脅迫作用存在最佳濃度效應(yīng)[29]. 因此后續(xù)試驗(yàn)中加Ca組菌株能維持較高OD600，這樣有利于保持高濃度的菌株并維持反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行.

2.2 Ca的添加對(duì)細(xì)菌耐受性的影響

由2.1節(jié)試驗(yàn)結(jié)果可知，P的添加對(duì)BacillusC075的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用但并不顯著，因此該部分著重討論Ca2+對(duì)細(xì)菌耐受性的影響. 由圖2可見，加入Pb后菌株生長(zhǎng)量與不加Pb對(duì)比有明顯降低，表明Pb對(duì)菌株生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；加Ca組中菌株生長(zhǎng)量有所提高，對(duì)Pb2+的耐受性有所增強(qiáng). 由Ca2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量的影響結(jié)果可知，一定濃度的Ca2+能最大程度地提高細(xì)菌生長(zhǎng)量，增強(qiáng)菌株對(duì)Pb的耐受性. 究其原因：一方面是由于Ca的添加能促進(jìn)細(xì)菌分裂，提高細(xì)菌生長(zhǎng)速率；另一方面，Ca2+與Pb2+會(huì)發(fā)生螯合作用生成共沉淀物，從而降低了c(Pb2+)，使Pb對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用有所減弱，從而增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)Pb的耐受性[30-31]. 田晶晶等[32]發(fā)現(xiàn)在37 ℃下，添加6%的碳酸鈣能有效改善環(huán)境的pH，極大促進(jìn)芽孢桿菌CGMCC 9951(BacilluscoagulansCGMCC 9951)生長(zhǎng)，從而提高對(duì)重金屬的耐受性. 添加Ca2+極有可能使得Ca2+與Pb2+進(jìn)行鰲合生成共沉淀物，從而降低Pb的毒性，提高細(xì)菌的耐受性.

圖2 Ca添加對(duì)Bacillus C075菌株耐受Pb的影響Fig.2 The effect of Ca addition on strain Bacillus C075 tolerance to Pb

2.3 P和Ca的添加對(duì)Pb2+礦化率的影響

相關(guān)研究表明，含磷物質(zhì)的添加可以降低土壤中Pb的有效性，磷化合物是通過形成穩(wěn)定Pb-P礦物質(zhì)來降低Pb的遷移性[15]. 微生物對(duì)重金屬的礦化作用可降低重金屬的遷移能力和生物有效性，是其可應(yīng)用于重金屬污染修復(fù)的重要原因之一[33]. P的添加對(duì)BacillusC075礦化重金屬Pb的影響結(jié)果如圖3所示. 從不接菌的對(duì)照試驗(yàn)中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Pb的去除率變化不大. 對(duì)于加菌組，比較P添加對(duì)礦化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，P添加后菌株對(duì)重金屬Pb的礦化率有一定程度的提高，其去除量由72 mg/L增至89 mg/L，增加了23.6%. 這表明菌株通過自身的酶、官能團(tuán)或是其他方式降低了環(huán)境中Pb的含量及其生物可利用性，菌株能通過酶化作用降解培養(yǎng)基中的底物，使得溶液中c(PO43-)增加，然后Pb2+會(huì)在酶的作用下與PO43-生成Pb5(PO4)3OH沉淀. 在此礦化過程中，細(xì)胞外聚合物和細(xì)胞壁提供吸附位點(diǎn)[34-35]. 由圖1(a)可見，P的添加對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響幾乎可以忽略，但P的添加直接增加了反應(yīng)體系中的PO43-，確保菌株在Pb2+礦化過程中有足夠的PO43-，從而進(jìn)一步提高了Pb2+的礦化率. Zhang等[36]也得到了類似結(jié)果，他們?cè)贐acillusZKJ對(duì)Pb2+的礦化試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在代謝過程中會(huì)將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為磷酸根，隨著溶液中PO43-濃度的不斷增加，細(xì)胞外聚合物會(huì)與Pb2+立即螯合. Teng等[37]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，LeclerciaadecarboxylataL1-5在200 mg/L的P溶液中將Pb2+礦化為Pb5(PO4)3OH. 在Pb生物礦化過程中，細(xì)菌細(xì)胞充當(dāng)成核位點(diǎn)，以支持Pb5(PO4)3OH晶體生成，這可進(jìn)一步提高Pb2+去除率，并且使礦化產(chǎn)物更穩(wěn)定、更致密[36].

圖3 P和Ca添加對(duì)Bacillus C075菌株礦化Pb2+的影響Fig.3 The influence of P and Ca addition on the mineralization of Pb2+ by strain Bacillus C075

礦化過程中，Ca的添加對(duì)BacillusC075的生長(zhǎng)繁殖和耐受性均有一定影響，進(jìn)而影響了菌株對(duì)Pb2+的礦化率. 加Ca前后BacillusC075對(duì)Pb2+去除率的影響如圖3所示，其去除率均隨著時(shí)間的增加而提高，反應(yīng)12 h后趨于穩(wěn)定，去除量從89 mg/L提高到113 mg/L，同比增加了26.9%，去除率增加了56.9%. 并且與未加Ca的兩組對(duì)照相比，加Ca后BacillusC075對(duì)Pb2+的去除率在0～12 h內(nèi)快速上升. 由圖1(b)可見，Ca的添加提高了菌株的生物活性，加Ca后的菌株具有較快的分裂能力，在一定程度上縮短了細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間，細(xì)菌得以快速繁殖，進(jìn)而使得加Ca后的BacillusC075對(duì)Pb2+的去除量最大且最先達(dá)到平衡狀態(tài). Tu等[38]在利用Bacillussp. dwc-2去除鈾(U)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著接種系統(tǒng)中孵育時(shí)間的增加，鈾的去除率也在增加，表明微生物活性在生物礦化中起著重要作用. 一些陰離子的存在也會(huì)影響生物礦化效率，如Wei等[39]發(fā)現(xiàn)，NH4+能促進(jìn)P相關(guān)礦化物的形成，而CO32-的存在則會(huì)降低礦化效率. Ca的添加能有效降低環(huán)境中的CO32-，而生成的碳酸鈣反而會(huì)促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，加速了礦化過程. Qian等[40]使用真菌PenicilliumchrysogenumCS1進(jìn)一步探討了加Ca后的菌株對(duì)重金屬Cr和Pb的去除影響，觀察到土壤中有更多可交換態(tài)重金屬離子與碳酸鹽結(jié)合. 土壤中可交換Cr的比例由41.60%降至1.95%，可交換Pb的比例由41.27%降至2.19%，這表明Ca的添加能進(jìn)一步促進(jìn)菌株對(duì)重金屬的礦化率[40]. 由此可見，加入一定濃度的Ca2+會(huì)提高BacillusC075對(duì)Pb2+的礦化率，進(jìn)一步證明了Ca2+在其礦化過程中的作用.

2.4 菌株礦化Pb2+的動(dòng)力學(xué)分析

為探究BacillusC075礦化過程中的磷酸酶活性和礦化反應(yīng)程度，測(cè)定不同Pb2+初始濃度下菌株的反應(yīng)速率V0，繪制菌株礦化Pb2+的動(dòng)力學(xué)曲線(見圖4).

圖4 Bacillus C075菌株礦化Pb2+的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curve of strain Bacillus C075 mineralized Pb2+

根據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步底物S與酶E形成中間復(fù)合物ES；第二步ES復(fù)合物分解形成產(chǎn)物，釋放出游離酶，Michaelis等[41]據(jù)此推導(dǎo)出米氏方程. 米氏方程表示底物濃度與酶反應(yīng)速率之間的定量關(guān)系：

V=Vmax[S]/(Km+[S])

(1)

式中：V為瞬時(shí)速率，mg/(h·g)；[S]為底物濃度，mg/L；Vmax為最大酶促反應(yīng)速率，mg/(h·g)；Km為米氏常數(shù).

當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而上升，而當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)，所有的酶被飽和，酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大，即Vmax.Km為酶的特性常數(shù)，僅與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無關(guān)，Km越小，表示菌株與磷酸酶的親和力越強(qiáng)，越有利于反應(yīng)[41]. 從曲線擬合得到解析式y(tǒng)=-0.009 13+0.513 67x，計(jì)算得出Vmax=1/0.009 13=109.53 mg/(h·g)，Pb的相對(duì)原子質(zhì)量為207.2，故Km=0.513 67×1 000/(0.009 13×207.2)=271.53 μmol/L.BacillussphaericusAND 303的Km為158.12 μmol/L，與所用菌株數(shù)值差異不顯著，這表明細(xì)菌與磷酸酶的親和力較強(qiáng)，更有利于礦化反應(yīng)的進(jìn)行[42]. 隨著c(Pb2+)的增加，酶促反應(yīng)速率不斷增大，這是由于底物濃度的增加為菌株提供了更多的酶反應(yīng)對(duì)象，從而促進(jìn)了反應(yīng)進(jìn)行，為反應(yīng)提供了更大的反應(yīng)初速率V0. 這表明隨著重金屬濃度的增加，菌株的初始反應(yīng)速率并未受到影響，這一方面排除了底物濃度對(duì)菌株礦化重金屬Pb的影響；另一方面表明，可能是由于其他方面的影響(如生長(zhǎng)量、官能團(tuán)和吸附位點(diǎn)等)導(dǎo)致隨著重金屬濃度持續(xù)增加，菌株的礦化能力有所降低. Teng等[37]在研究P增溶性細(xì)菌固定Pb時(shí)發(fā)現(xiàn)，磷酸酶活性和礦化反應(yīng)呈正相關(guān)，磷酸酶活性可作為礦化反應(yīng)的良好指標(biāo). Wei等[39]利用Bacillusthuringiensis016對(duì)UO22+進(jìn)行固定化研究，發(fā)現(xiàn)和缺乏酶的細(xì)胞碎片相比，完整細(xì)胞對(duì)UO22+具有更好的生物礦化能力. 這說明酶活性會(huì)影響菌株對(duì)重金屬的礦化作用.

2.5 礦化物的FT-IR及XRD分析

圖5 P和Ca添加前后礦化物的FT-IR和XRD圖譜Fig.5 FT-IR and XRD patterns of the mineralization before and after P and Ca addition

為了進(jìn)一步確定礦化物的組成，采用XRD對(duì)其進(jìn)行定性分析，結(jié)果如圖5(b)所示. 在未加P和Ca的樣品圖譜中出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)且窄的衍射峰，通過與PDF標(biāo)準(zhǔn)卡(PDF#08-0259)比較，發(fā)現(xiàn)二者相似度很高，所以可以確定生成的礦化物是Pb5(PO4)3OH. 由圖5(b)可見，P的添加未改變礦化產(chǎn)物種類，但添加P后樣品圖譜中的衍射峰峰值更高、更尖銳，表明加P后礦化物的結(jié)晶度較未加P的樣品更好. 由此可知，P的添加雖然不會(huì)對(duì)礦化物種類產(chǎn)生影響，但提高了礦化物的結(jié)晶度和純度，使礦化物更穩(wěn)定. Zhao等[46]對(duì)Phanerochaetechrysoporium礦化Pb2+的礦化產(chǎn)物進(jìn)行XRD分析，結(jié)果表明礦化產(chǎn)物同樣為Pb5(PO4)3OH. Zhang等[36]利用溶磷菌對(duì)Pb2+進(jìn)行礦化，XRD結(jié)果顯示，溶磷菌礦化Pb2+的產(chǎn)物為Pb3(PO4)2或Pb5(PO4)3OH 沉淀. 他們的結(jié)果與筆者試驗(yàn)所得結(jié)論相一致. 當(dāng)同時(shí)添加P和Ca時(shí)，Ca的加入使得礦化物類型發(fā)生了改變，Pb2+替換了羥基磷酸鈣中Ca2+的晶格[47]，從而形成了Ca2Pb8(PO4)6(OH)2. 這與Chen等[13]的研究結(jié)果類似，他們利用Bacilluscereus12-2探討其對(duì)Pb2+的礦化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在該細(xì)菌誘導(dǎo)的Pb2+生物礦化過程中，Ca不僅作為細(xì)菌細(xì)胞的必要成分，同時(shí)也可進(jìn)一步用于形成結(jié)晶礦物——Ca2.5Pb7.5(PO4)6(OH)2. Govarthanan等[48]在研究Baciliussp.KK1對(duì)尾礦中Pb的生物礦化的意義時(shí)指出，重金屬離子以替代Ca2+的晶格的形式形成新的沉淀，從而提高礦化效率.

2.6 礦化物的SEM和EDS以及BET分析

細(xì)菌活動(dòng)中的礦化過程能控制礦化物的成核和生長(zhǎng)[11,49]，外界環(huán)境變化也會(huì)對(duì)礦化物種類產(chǎn)生影響. 對(duì)加P和Ca后的樣品進(jìn)行SEM分析，以便觀察礦化物的分布情況. 由圖6可見，未加P和Ca的空白試驗(yàn)組的礦化物沉淀以顆粒狀團(tuán)聚，粒徑大小不一，顆粒間結(jié)合比較緊密，團(tuán)聚狀態(tài)十分良好. P和Ca的添加使得芽孢桿菌表面附著的沉淀物明顯增多，并且礦化物的產(chǎn)品更穩(wěn)定、更致密. 這也進(jìn)一步證明了P和Ca的添加能提高BacillusC075對(duì)Pb2+的礦化率. Zhang等[36]在利用BacillusZKJ礦化去除Pb時(shí)發(fā)現(xiàn)，將細(xì)菌接種到含P培養(yǎng)基中能進(jìn)一步提高去除率，并使得礦化產(chǎn)物更加穩(wěn)定和致密.

圖6 P和Ca添加前后礦化物的SEM和EDS圖譜Fig.6 SEM and EDS spectra of mineralization before and after P and Ca addition

為進(jìn)一步得到沉淀物的元素組成，分別對(duì)P和Ca添加前后的樣品進(jìn)行EDS能譜分析. 由圖6可見，在未加Ca的條件下，加P前后沉淀物的EDS能譜發(fā)生了變化，P峰和Pb峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明P的添加會(huì)促進(jìn)菌株對(duì)Pb2+的吸附. 此外，加Ca后礦化物的EDS譜圖中Ca峰和P峰有很大程度的增強(qiáng). 這可歸因于Ca的添加促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)以及菌株對(duì)PO43-的利用率，從而進(jìn)一步提高了對(duì)Pb2+的去除效果. 由EDS和XRD譜圖可知，加Ca前后的礦化物由Pb5(PO4)3OH轉(zhuǎn)變?yōu)镃a2Pb8(PO4)6(OH)2，表明Ca的添加改變了BacillusC075礦化Pb2+的產(chǎn)物類型. 而周吉峙等[50]發(fā)現(xiàn)，Ca2Pb8(PO4)6(OH)2擁有更好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在400 ℃下仍然不會(huì)被分解.

為探究BacillusC075礦化過程中菌株表面的剩余吸附面積和吸附位點(diǎn)的變化，分別對(duì)P和Ca添加前后的樣品進(jìn)行BET分析. 由圖7(a)可見，等溫線呈下降趨勢(shì)，在較低相對(duì)壓力下其N2吸附量幾乎為0(圖中呈現(xiàn)為負(fù)值)，在飽和蒸氣壓下驟然升至18.02 cm3/g，其比表面積為 0.760 4 m2/g，孔容為0 cm3/g. 這表明菌株表面已經(jīng)沒有吸附位點(diǎn)，吸附能力達(dá)到飽和狀態(tài)，吸附受到限制[51]. 由圖7(b)可見，加入P后的礦化物的等溫線與未加P和Ca的礦化物的等溫線類似，但是在較低相對(duì)氣壓下N2吸附量呈上升趨勢(shì)且為正值，在飽和氣壓下升至26.78 cm3/g，比表面積為13.088 0 m2/g，孔容為 0.001 460 cm3/g. 這表明在加入P之后，菌株有更大的吸附面積和更多的吸附位點(diǎn)，吸附能力顯著提高. 由圖7(c)可見，加入P和Ca后的礦化物的等溫線出現(xiàn)明顯變化，在較低相對(duì)壓力下吸附量呈升高趨勢(shì)，且一直增加至飽和蒸氣壓下的最大值27.80 cm3/g，其比表面積為 8.501 6 m2/g，孔容為 0.002 957 cm3/g. 這表明在加入Ca以后，雖然吸附面積減少了，但是吸附點(diǎn)位增加了，使得整體的吸附能力提高. 而在加入P和Ca后礦化物的等溫線中間段出現(xiàn)了吸附回滯帶，表明菌株表面存在毛細(xì)凝聚體系. 中孔毛細(xì)凝聚填滿后，菌株表面還有大孔徑的孔或者吸附質(zhì)分子相互作用較強(qiáng)，可能吸附形成多分子層，吸附等溫線繼續(xù)上升直至出現(xiàn)吸附終止平臺(tái)，停止吸附[51]. 總而言之，加入P組的吸附效果優(yōu)于不加P組，而加入P和Ca的吸附效果最佳.

圖7 P和Ca添加前后礦化物的BET圖Fig.7 BET spectra of mineralization before and after P and Ca addition

3 結(jié)論

a) P的添加對(duì)BacillusC075的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，但并不顯著，但Ca2+能顯著促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，并且增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)Pb2+的耐受性. 添加的最佳c(Ca2+)為10 mmol/L.

b) 在加入P和Ca后，BacillusC075對(duì)Pb2+的去除率有顯著提升，加入P后的去除量與不加P相比提高了23.6%，而同時(shí)加入P和Ca后的去除量與不加P相比則提高了56.9%.

c) 在加入P后，BacillusC075能將Pb2+誘導(dǎo)礦化生成Pb5(PO4)3OH，P的添加增加了菌株表面吸附面積和吸附位點(diǎn)，提高了礦化率，并未影響礦化物的種類. 同時(shí)添加P和Ca后不僅顯著提高了菌株對(duì)Pb2+的礦化率，還最大程度地利用了外加的Ca，進(jìn)而改變了礦化物的種類，生成了Pb5(PO4)3OH和Ca2Pb8(PO4)6(OH)2，Ca2Pb8(PO4)6(OH)2擁有更好的穩(wěn)定性. 因此，P和Ca的添加在微生物修復(fù)重金屬污染方面具有較為廣闊的應(yīng)用前景.