30種觀葉秋海棠花粉活力檢驗方法篩選及活力測定

杜文文，段 青，楊 楠，蔡晶晶，林培勝，馬璐琳，王祥寧，賈文杰，崔光芬*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；3.大姚縣六苴鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心 ，云南 大姚 675400)

【研究意義】秋海棠屬于秋海棠科秋海棠屬，多年生草本植物，約1900種、15000多個園藝品種[1-2]。依據(jù)觀賞性，可分為觀花、觀葉和花葉兼賞3類[3]，其中觀葉類葉形、葉色變化豐富，有很多種類具有多彩的葉斑，深受人們喜愛，是極佳的花鏡材料，具有市場前景。培育新的觀葉秋海棠品種，不僅可以滿足市場需求，還能創(chuàng)造新的種質(zhì)，豐富該物種的多樣性。雜交育種是新品種選育的重要手段，較高的花粉活力是確保授粉受精正常進(jìn)行的前提條件[4]，因此，測定秋海棠花粉活力能為優(yōu)良授粉品種選配提供重要依據(jù)，有效提高雜交結(jié)實率，對雜交育種成功與否具有實際指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花粉活力最常用的測定方法有染色法[5-7]和花粉離體培養(yǎng)法[8-10]。染色法操作簡便，能快速測定花粉活力，但受花粉自身特性影響大，穩(wěn)定性差，離體培養(yǎng)法雖能較真實反應(yīng)花粉活力，但在無資料可參考的情況下，需進(jìn)行一系列預(yù)備實驗，以確定最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，操作復(fù)雜[11-13]。因此，不同種類應(yīng)選擇合適的方法檢測其花粉活力。目前有關(guān)秋海棠花粉活力的報道較少，且主要為野生種類，陳雄偉等[14]采用I2-KI染色法測定了紫背天葵(B.fimbristipulaHance)花粉活力，花開后3 d活力最強(qiáng)。通過離體培養(yǎng)，趙寶林等[15]觀察到中華秋海棠[B.grandisDry subsp. (A. DC.) Irmsch]從開放幾小時到即將萎蔫的雄花花粉均有活力。彭鏡毅等[16]運用孢粉染色法檢測出臺北秋海棠(Begonia×taipeiensis)花粉敗育率極高。Dewitte 等[17]用Fluorescein diacetate (FDA)染色法觀測南美洲秋海棠7個雜交組合后代的花粉活力，平均活力只有3.5%，73%的雜交后代敗育?！颈狙芯壳腥朦c】觀葉秋海棠種類較多，而針對更多的野生種和市場上流行的商業(yè)品種的花粉活力研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以30種觀葉秋海棠為試材，采用不同方法測定其花粉活力，尋找測定秋海棠花粉活力的有效方法，比較不同種類之間花粉活力大小的差異，為觀葉秋海棠雜交育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30種觀葉秋海棠，種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所秋海棠育種基地，包括15個野生種和15個商業(yè)品種，均具一定觀賞性。

1.2 試驗方法

各種類秋海棠的花期集中在9-10月，中午采集盛花期雄花帶回實驗室，采用不同方法測定花粉活力，同時采集了火焰開放1～8 d的雄花和雌花，觀察火焰不同開放天數(shù)雄花花粉的活力和雌花柱頭的可授性。

1.2.1 TTC染色法 稱TTC 0.5 g或1 g溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖溶液中，配好的溶液倒入棕色試劑瓶內(nèi)，4 ℃保存待用。檢測時選取5個種類，先進(jìn)行預(yù)實驗，取2～3滴TTC染液于載玻片上，用毛筆將它們的新鮮花粉分別輕彈到各自載玻片溶液中，35 ℃恒溫箱染色30 min 左右，鏡檢，紅色花粉粒有活力，淡紅色或無色花粉?；盍Φ突驘o活力[6]。重復(fù)6次，每個玻片取6個視野進(jìn)行統(tǒng)計，每個視野中的花粉粒數(shù)不少于30 粒。若5個種類均可染色，則其他種類也采用此方法。

花粉活力(%)=紅色花粉數(shù)量/觀測花粉總數(shù) × 100

1.2.2 I2-KI 染色法 配置2% I2-KI 溶液，置于棕色試劑瓶中4 ℃保存待用。方法與TTC法類似，先進(jìn)行預(yù)實驗，染色10 min后在顯微鏡下觀察，有活力的花粉呈藍(lán)色，活力衰弱或內(nèi)含物少的花粉呈黃褐色[6]。若預(yù)實驗成功，則用該方法檢測所有種類花粉。

花粉活力(%)= 藍(lán)色花粉數(shù)量/觀測花粉總數(shù) × 100。

1.2.3 孢粉染色法 參照陳家瑞[18]的孢粉染色法。稱取95%乙醇10 mL，孔雀綠10 mg，蒸餾水50 mL，丙三醇25 mL，酚5 g，水合氯醛5 g，酸性品紅50 mg，桔紅G 5 mg，冰醋酸1～4 mL，配制孢粉染液，其中冰醋酸量的加入依孢粉壁的厚度而定，薄的用1～2 mL，厚的用3～4 mL。配好的試劑倒入棕色瓶內(nèi)，暗處保存。檢測方法同上述方法，室溫染色30～40 min后顯微鏡下觀察。有活力的花粉原生質(zhì)紅色，無活力的花粉細(xì)胞壁被染成綠色。

花粉活力(%)=紅色花粉粒數(shù)/觀測花粉?？倲?shù) × 100

1.2.4 離體培養(yǎng)法 離體培養(yǎng)基為10% 蔗糖 + 0.01% H3BO3+ 0.01% CaCl2+ 0.02% MgSO4·7H2O+0.01% KH2PO4的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，花粉均勻撒在培養(yǎng)皿上，25 ℃光照或黑暗培養(yǎng)3～4 h，花粉管萌發(fā)長度超過1/2 花粉直徑，則視為具有活力。3 次重復(fù)，每個重復(fù)觀察6個視野，求平均值作為花粉萌發(fā)率，同樣選取5個種類進(jìn)行預(yù)實驗。

花粉萌發(fā)率(%)= 萌發(fā)花粉粒數(shù)/觀測花粉?？倲?shù) × 100

1.2.5 柱頭可授性 采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定[19]，將火焰不同開放天數(shù)雌花的柱頭，置于聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液中，反應(yīng)液配方為1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22(體積比)。若柱頭具有可授性，其周圍呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡產(chǎn)生。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SAS軟件對不同種類的花粉活力進(jìn)行單因素方差分析，使用R軟件繪制30種秋海棠花粉活力大小、聚類圖與火焰不同開放天數(shù)花粉活力變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種花粉活力測定方法比較與分析

銀點秋海棠(B.deliciosaLinden ex Fotsch)、火焰、晚秋紅、冰川和蕾絲洛森的花粉經(jīng)TTC 溶液或I2-KI溶液染色后，花粉顏色均未有明顯變化，染色時間延長，效果仍不理想；花粉經(jīng)過夜離體培養(yǎng)后未觀察到萌發(fā)；孢粉染色法中所有種類花粉均可被染色，且能很好的區(qū)分有活力花粉和敗育花粉(圖1)，這一結(jié)果表明TTC和I2-KI染色法可能不是檢測秋海棠植物花粉最有效的方法，實驗所用的離體培養(yǎng)基不適合秋海棠植物花粉活力檢測，相比較其他3種方法，孢粉染色法可用于秋海棠植物花粉活力的快速測定。

2.2 不同種類花粉活力大小比較與分析

由于TTC染色、I2-KI 染色和花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)3種方法均未獲得有效數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果只針對孢粉染色法測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有種類花粉均可被染色，且能很好的區(qū)分有活力花粉和敗育花粉(圖1-c)。測定的30種秋海棠花粉均有活力，花粉活力范圍為34.83%～98.58%，花粉活力橙花秋海棠(B.croceaC.I Peng)最高(98.58%)，火焰最低(34.83%)，極差為63.75%；不同種類之間花粉活力差異大，15個野生種中，除中華秋海棠(B.grandis)(76.66%)、坪林秋海棠(B.pinglinensisC. I Peng)(79.59%)、棱角秋海棠(B.angularisRaddi)(82.61%)和歪葉秋海棠(B.augustineiHemsl)(84.32%)4個種類花粉活力低于85%外，其余11個的均高于90%，野生種的平均花粉活力為91.39%。15個商業(yè)品種中，紅寶石鞋花粉活力高，為90.81%，蕾絲洛森、北極風(fēng)、火燒云和晚秋紅花粉活力在80%～90%，分別為87.32%、86.95%、86.02%和83.42%；花粉活力在 70%～80%有4個，為星光(79.24%)、粉絲帶(77.90%)、煙霞(75.73%)和薩爾薩(75.61%)，而非洲叢林(68.11%)、紅色探戈(65.04%)和埃特納(61.67%)3個品種的花粉活力則在60%～70%，冰川花粉活力稍低于60%，為58.61%，小可愛(43.88%)和火焰(34.83%)花粉活力均低于50%，商業(yè)品種的平均花粉活力為71.67%(表1，圖2)，說明測定的30種觀葉秋海棠中，野生種的平均花粉活力較商業(yè)品種高。一般雜交選配時，除觀賞性、抗逆性、授粉親和性、花粉活力外，花粉量也是選擇父本的重要因素[20]，采集花粉時發(fā)現(xiàn)，所測的28個花粉活力較高的種類，其花粉量也較多，花粉活力低的小可愛和火焰花粉量則偏少，因此，雜交時橙花秋海棠、紅寶石鞋等28個種類可以做父本，小可愛和火焰則做母本更好。

表1 30種秋海棠花粉活力

除柳葉秋海棠(B.fuchsioidesHook.)和長翅秋海棠(B.longialataK. Y. Guan & D. K. Tian)、彩紋秋海棠(B.masonianavar.maculataS. K. Chen, R. X. Zheng & D.Y. Xia)和光滑秋海棠(B.psilophyllaIrmsch.)、蕾絲洛森和北極風(fēng)、粉絲帶和中華秋海棠、煙霞和薩爾薩、非洲叢林和紅色探戈、埃特納和冰川花粉活力標(biāo)注的字母一樣外(P>0.05)，其他種類花粉活力兩兩比較，標(biāo)注字母均不同，有的種類間還存在顯著差異(P<0.05)；火焰和小可愛相比，花粉活力差異顯著，且二者顯著低于其他28種秋海棠(P<0.05，表1)。采用最短距離法對30種秋海棠進(jìn)行聚類，在遺傳距離0.2處，可將30種秋海棠分為6個類群，第Ⅰ類群包含12個種類，花粉活力均在90%以上，第Ⅱ類群也包含12個種類，花粉活力在75%～90%，第Ⅲ類群包含兩個種類，為非洲叢林和紅色探戈，花粉活力在70%左右，第Ⅳ類群也包含兩個種類，為埃特納和冰川，花粉活力在60%左右，第Ⅴ類群和第Ⅵ類群都只包含一個種類，分別為小可愛和火焰，花粉活力均低于50%(圖3)，說明秋海棠花粉活力多樣性豐富。

2.3 火焰花朵開放不同天數(shù)花粉活力和柱頭可授性分析

火焰花粉量少，花朵開放1 d的雄花散粉極少，數(shù)據(jù)不易采集，開放8 d花朵萎蔫，常脫落，故只觀測了花朵開放2～7 d的花粉活力，也說明火焰單花周期為7 d左右。開花后2、3、4、5、6、7 d，花粉活力均較低，分別為32.48% 、32.51%、33.28%、42.15%、36.82%、36.47%，花粉活力大小變化趨勢為先增大后減小，花開后5 d花粉活力最強(qiáng)(42.15%,圖4)。柱頭可授性表明，火焰雌花自開放到凋落，其柱頭均有可授性，因此，該種類雜交時更適合做母本。采集雄花時發(fā)現(xiàn)花藥散粉量會隨開放天數(shù)增加而增多(圖5)，雜交育種中有采用火焰花粉進(jìn)行授粉獲得雜交種子的情況，因此，若以火焰為父本進(jìn)行雜交，宜采用開放5 d的雄花進(jìn)行授粉。

火焰葉片肉質(zhì)，卵形，整個葉片為紅色，有金屬光澤，符合中國人的審美，具有較好的市場前景，但株形松散、不緊湊，降低了觀賞性，且不利于包裝和運輸，為獲得更多的雜交種子，培育更好的紅色觀葉秋海棠品種，可以用火焰為母本，與株型緊湊的父本品種進(jìn)行雜交，或者以株型緊湊的品種為母本，采用開放5 d左右的火焰花粉進(jìn)行授粉，選育葉色、株型更優(yōu)良的后代。

3 討 論

3.1 秋海棠花粉活力測定方法

研究中采用4種方法檢測秋海棠花粉活力，結(jié)果TTC和I2-KI 染色效果不理想，離體培養(yǎng)基上未見花粉萌發(fā)，只有孢粉染色法可以很好地區(qū)分有活力花粉和無活力花粉，前人采用I2-KI染色和離體培養(yǎng)法分別檢測紫背天葵和中華秋海棠的花粉活力[14-15]，與預(yù)實驗結(jié)果有不同，這可能是所選擇的秋海棠種類不同或溶液或培養(yǎng)基配方有差異所致；彭鏡毅等[16]使用孢粉染色能有效觀察臺北秋海棠花粉活力，也有相同實驗結(jié)果。

測定的30種觀葉秋海棠，不同種類之間花粉活力存在差異，野生種中有11個花粉活力在90%以上，其余4個的也高于75%；商業(yè)品種中花粉活力較高的有紅寶石鞋(90.51%)、蕾絲洛森(87.42%)、晚秋紅(83.42%)和星光(79.24%)等，而火焰和小可愛花粉活力則偏低，實際雜交過程中也發(fā)現(xiàn)測定的部分野生種如光滑秋海棠、掌葉秋海棠、銀點秋海棠等和部分商業(yè)品種如蕾絲洛森、北極風(fēng)、晚秋紅、星光等自交和雜交結(jié)實率均較高，而 火焰與其他種類雜交時，雜交結(jié)實率低、小可愛做父本幾乎不能獲得雜交種子，說明孢粉染色法所得數(shù)據(jù)可靠，可以作為測定秋海棠植物花粉活力的一種快速有效測定方法。

3.2 秋海棠多樣性與可育性

秋海棠多樣性極其豐富，種類、生態(tài)、生境、形態(tài)特征、染色體、基因組大小等方面均表現(xiàn)出多樣性[21-23]。通過最短距離法可以將30種秋海棠分為6個類群，花粉活力大小分別為90%以上、75%～90%、70%左右、60%左右、45%左右和35%左右，說明秋海棠花粉活力也存在多樣性，進(jìn)一步豐富了對秋海棠屬植物多樣性的認(rèn)識。

花粉活力能夠作為反映雄配子發(fā)育狀況的一項指標(biāo)，對花粉活力進(jìn)行分級，可以將不同品種劃分為不同等級的育性，并為后續(xù)雜交親本選配提供依據(jù)。一般花粉可育率為0，定為全不育；小于5%，為高不育；6%～30%，為半不育；31%～50%，為低不育；大于50%，為正常可育[24]。參照這種等級法，可將30種觀葉秋海棠劃分為正?？捎偷筒挥齼深?，其中正常可育含有28個種類，雜交時可以做父本，低不育有2個種類，適宜做母本。

3.3 花粉活力變化

檢測到火焰不同開放天數(shù)花朵的花粉活力隨開放天數(shù)的增加先增大后減小，開放后5 d活力最高。紫背天葵花朵的花粉活力也是隨開放天數(shù)的增加呈先增加后下降的趨勢，開花后3 d 花粉活力達(dá)到最高(76.0%)[14]。楊小丹等[25]在研究不同品種蘭花花粉活力時，發(fā)現(xiàn)國蘭花粉活力在花朵開放0 ～20 d處于增長期，之后花粉活力隨花朵開放時間的增加而降低。因此，雜交時應(yīng)先確定植物花粉活力最高的時期，并選擇該時期進(jìn)行雜交授粉，這樣有助于提高雜交結(jié)實率。

4 結(jié) 論

孢粉染色法可以快速有效的測定秋海棠植物花粉活力，秋海棠花粉活力多樣性豐富，本實驗的30種觀葉秋海棠有28個種類正常可育，可作父本進(jìn)行雜交，小可愛和火焰為低不育，雜交時更適合做母本，火焰若做父本，應(yīng)采集開放5 d的花粉，該項研究對提高雜交效率具有實際指導(dǎo)意義。