菌根真菌與不同苗齡滇重樓幼苗的共生效應(yīng)

許凌峰，黃艷萍，郭冬琴，楊 敏，張 杰，趙晶晶*，周 濃*

(1. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 萬州 404120；2. 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

【研究意義】滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnansensis)是百合科重樓屬植物，主要分布于我國西南地區(qū)，其干燥根莖為一種清熱解毒名貴中藥材，是“宮血寧膠囊”、“云南白藥”等多種中成藥的主要原料，已被2015版中國藥典收載[1]。市場上的重樓藥材多年以來主要依賴于野生采挖，導(dǎo)致野生資源幾近枯竭，目前滇重樓已被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材瀕危物種[2-3]。因此，尋找合適的滇重樓人工育苗方法顯得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)中的土壤有益微生物，能與大部分植物根系形成互惠共生體[4]。研究表明，AMF可提高藥用植物移栽成活率和結(jié)實(shí)率，促進(jìn)寄主植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，尤其是磷元素的吸收，提高藥用植物抗逆性，影響其次生代謝產(chǎn)物的形成等等[5-6]。共生受體樣蛋白激酶基因(SYMRK)與產(chǎn)生鈣離子振蕩的通道蛋白基因(DMI1)是AMF早期共生信號途徑的關(guān)鍵基因[7-8]，這些編碼基因在水稻等經(jīng)濟(jì)作物中的研究報(bào)導(dǎo)較多，而作為瀕危物種藥物來源的滇重樓研究鮮見報(bào)道，菌根化的滇重樓幼苗內(nèi)SYMRK和DMI1在不同種源、不同接種時(shí)期和不同采收時(shí)期中是如何變化的有待研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】滇重樓主要以根莖入藥，故滇重樓根莖與AMF共生關(guān)系的研究，有利于探知影響滇重樓根莖品質(zhì)的本質(zhì)。本課題組先前關(guān)于接種不同AMF對滇重樓菌根侵染率、幼苗光合參數(shù)、入藥品質(zhì)以及功能基因表達(dá)的影響進(jìn)行了初步研究[9-11]，甄選出了多種較利于滇重樓生長的AMF?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從前期的研究中選擇了透明盾巨孢囊霉(Scutellosporapellucida)、美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)、球狀巨孢囊霉(Gigasporamargarita)、微白巨孢囊霉(Gigasporaalbida)、玫瑰紅巨孢囊霉(Gigasporarosea)、巨大巨孢囊霉(Gigasporagigantea)、亮色盾巨孢囊霉(Racocetrafulgida)、瑚狀盾巨囊霉(Racocetracoralloidea)、沙荒球囊霉(Septoglomusdeserticola)、明球囊霉(Rhizophagusclarus)、根內(nèi)球囊霉(Rhizophagusintraradices)、近明球囊霉(Claroideoglomusclaroideum)12種優(yōu)良的單株AMF進(jìn)行菌劑組合[10-11]，共計(jì)九組AMF的組合進(jìn)行深入研究，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行幼苗須根功能基因表達(dá)量(SYMRK和DMI1)及菌根侵染率、侵染強(qiáng)度、琥珀酸脫氫酶(SDH)和堿性磷酸酶(ALP)活性的測定，為滇重樓高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試叢枝菌根真菌

通過美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)購得純凈的AMF菌劑，在三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室(重慶三峽學(xué)院)進(jìn)行菌劑的擴(kuò)繁和保存，根據(jù)課題組前期的試驗(yàn)結(jié)果[9-11]，將篩選出來的優(yōu)良單株AMF進(jìn)行組合，其組合方式見表1，接種物由孢子、菌絲和菌根片段組成根際混合物。

表1 不同處理及其接種AM真菌

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采收的新鮮種子常溫下河沙貯存4個(gè)月，經(jīng)三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室(重慶三峽學(xué)院)周濃教授鑒定為百合科植物滇重樓Parispolyphyllavar.yunnanensis的成熟種子，種子采用單株保存的方式以保證種質(zhì)資源的穩(wěn)定性和均一性。依次于2013年1月和2014年1月進(jìn)行播種，滇重樓種子去除外果皮后，用10%次氯酸鈉溶液浸泡15 min進(jìn)行消毒，再用蒸餾水沖洗4～5次備用；菜園土和河沙按照3∶1的體積比進(jìn)行混合作為培養(yǎng)基質(zhì)，置于1×105Pa滅菌2 h備用。采用溫室栽培法，共設(shè)置9個(gè)菌劑處理(S1～S9)和1個(gè)對照(CK，S10)共10個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置10次重復(fù)，待滇重樓出苗后每盆間苗20株，各處理每盆接種含180個(gè)孢子的混合菌劑(均分)，滇重樓幼苗生長期間定期澆Hoagland營養(yǎng)液。

具體的種源、育苗時(shí)期、AMF接種時(shí)期及樣品采收時(shí)期見表2。收獲后的滇重樓植株在冰水浴中洗凈根系，采用何忠俊等[12]報(bào)道的方法，剪成1.0～1.5 cm長的根段，一部分置于FAA固定液中用于菌根侵染率和侵染強(qiáng)度的測定；一部分保存在液氮中用于根內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性及功能基因表達(dá)量的測定。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 叢植菌根真菌的分析與評價(jià)

隨機(jī)選取浸泡于FAA固定液中的滇重樓根系30條，采用Philips JM等[13]的方法染色、制片、鏡檢，根據(jù)Trouvelot等[14]的方法統(tǒng)計(jì)菌根侵染率和侵染強(qiáng)度。根內(nèi)菌絲堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶活性測定采用組織化學(xué)染色法[15-16]。

1.4 滇重樓幼苗根莖功能基因表達(dá)量的測定

總RNA提取按照SGTriEx高純總RNA提取試劑盒說明書提取樣品。取0.1 g根莖樣本提取總RNA，經(jīng)過純化后合成cDNA。其過程為：RNA模板5 μg，Oligo(dT)18引物1 μL，5× Reaction Buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RT enzyme 1 μL，加DEPC處理至20 μL后，混勻，離心，42 ℃水浴60 min，85 ℃水浴10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，直接用于Real-time PCR擴(kuò)增。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：滇重樓2個(gè)功能基因(SYMRK和DMI1)及內(nèi)參基因(Actin)的引物序列見表3。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為15 μL: 2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，上下游物引物各0.25 μL，cDNA 2 μL，nuclease-free water 6 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，95 ℃ 15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s。每個(gè)樣品每個(gè)基因3個(gè)PCR平行反應(yīng)。以Actin為內(nèi)參，采用比較Ct方法計(jì)算出2個(gè)功能基因的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，運(yùn)用SPSS20.0及Prizm 4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下菌根侵染率和侵染強(qiáng)度的變化

由圖1可見，AMF與滇重樓幼苗形成了良好的共生關(guān)系，其幼苗菌根的侵染率達(dá)到了80.00%以上，但CK未被侵染?？傮w上看，T2期的侵染率相對較低，其中T2期S5的侵染率最低?？梢?，接種外源AMF對滇重樓根系菌根侵染率具有一定的促進(jìn)作用。

接種時(shí)期對滇重樓幼苗根系侵染強(qiáng)度的影響見圖2，AMF對不同接種時(shí)期滇重樓幼苗侵染強(qiáng)度的影響差異顯著，但CK未有侵染，各處理的侵染強(qiáng)度在18.85%～92.50%，其中T1期的S8侵染強(qiáng)度最高(92.50%)，T3期的S3侵染強(qiáng)度最低(18.85%)。在接種和取樣時(shí)期相同時(shí)，栽培種源(T1)接種S1、S2和S3菌劑時(shí)，其AMF侵染強(qiáng)度顯著高于野生種源(T3)，野生種源(T3)接種S7、S8和S9菌劑時(shí)，其AMF侵染強(qiáng)度較高。這說明栽培種源更適合接種AMF。在種源和采收時(shí)期相同，而接種時(shí)期不同時(shí)即T1、T4與T5相比，T1和T4各處理的侵染強(qiáng)度均高于T5，這說明在滇重樓播種或一年實(shí)生苗期接種AMF更有利于其侵染強(qiáng)度的增加?？傮w上看，不同接種時(shí)期接種不同AMF時(shí)，其菌根的侵染率與侵染強(qiáng)度存在差異，這說明接種AMF在人工栽培滇重樓幼苗中是可行的?？傮w來看，當(dāng)菌種不同時(shí)，S2、S6和S7處理的菌根侵染率和侵染強(qiáng)度相對較高，表明這3種混合菌劑在滇重樓人工栽培上接種的效果更好。

2.2 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下根內(nèi)堿性磷酸酶活性的變化

由根內(nèi)ALP活性和強(qiáng)度2個(gè)參數(shù)(圖3)可知，滇重樓接種AMF對其根內(nèi)的ALP影響顯著，但CK未檢測出ALP，各處理的ALP活性范圍在9.09%～90.91%，表明菌絲具有生命力，均為活性。具有ALP活性的真菌在整個(gè)根系的發(fā)生強(qiáng)度不盡相同，各處理的ALP強(qiáng)度在1.36%～18.12%，AMF對不同接種時(shí)期滇重樓幼苗根內(nèi)ALP侵染強(qiáng)度的影響差異顯著，與CK相比，所有處理的ALP侵染強(qiáng)度均提高，表明外源接種AMF可提高滇重樓菌根真菌的生物學(xué)活性[17]。在接種和取樣時(shí)期相同時(shí)，除接種S1、S9菌劑外，接種其余菌劑時(shí)栽培種源的ALP活性均高于野生種源。在接種時(shí)期和種源相同而取樣時(shí)期不同時(shí)，即T1和T2相比，T2的ALP活性和強(qiáng)度均略好于T1。在種源和采收時(shí)期相同，而接種時(shí)期不同時(shí)，即T1、T4與T5相比，T4期的ALP活性和強(qiáng)度最大，這說明T4期接種AMF可使滇重樓根系的生命力更旺盛，而T1期和T5期的ALP活性普遍偏低?？傮w來看，當(dāng)菌種不同時(shí)，S2、S6和S7處理的根內(nèi)ALP活性較強(qiáng)，說明滇重樓幼苗接種這3種混合菌劑后菌絲的生命力更強(qiáng)些。

2.3 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下根內(nèi)琥珀酸脫氫酶活性的變化

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同AMF處理后滇重樓幼苗根系的檢出率均到達(dá)了100%，但CK未檢測到SDH，這說明所有處理的滇重樓的菌根均為活性菌絲，進(jìn)一步表明了滇重樓對菌根真菌具有較強(qiáng)的依賴性[10]。由圖4可知，具有SDH活性的真菌在整個(gè)根系的發(fā)生強(qiáng)度不盡相同，在接種和采收時(shí)期相同時(shí)，栽培種源的SDH活性高于野生種源，野生種源接種S7和S9菌劑時(shí)SDH活性較高，接種其余菌劑時(shí)活性菌絲數(shù)量較少，主要與播種時(shí)接種有關(guān)。各處理的SDH活性在11.25%～70.00%，而CK的滇重樓幼苗根系均無SDH活性，其中T5期的S8處理活性最低，為11.25%，T2期的S8處理活性最高為70.00%，可見，外源接種AMF促進(jìn)了滇重樓菌根的生命力活動，與馮海艷等[16]對玉米接種AM真菌的研究結(jié)果一致。在接種時(shí)期和種源相同，采收時(shí)期不同時(shí)，即T1和T2相比，T1和T2的SDH活性和強(qiáng)度未有顯著差異。在種源和采收時(shí)期相同，而接種時(shí)期不同時(shí)，即T1、T4與T5相比，T1和T4期的SDH活性和強(qiáng)度較大，而T5期的SDH活性和強(qiáng)度普遍偏低?？傮w來看，當(dāng)菌種不同時(shí)，S2、S6和S7處理的根內(nèi)SDH活性較強(qiáng)，說明滇重樓接種這3種混合菌劑更有利于提高其菌絲的生命力。

2.4 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下幼苗SYMRK基因表達(dá)量的變化

由圖5可知，在播種和采收時(shí)期相同時(shí)，栽培種源與野生種源相比，即T1與T3相比，除S3、S4和S9處理外，野生種源幼苗的SYMRK基因相對表達(dá)量較高，其中T3期S6的表達(dá)量最高，與CK相比，存在極顯著差異。在種源和播種時(shí)期相同時(shí)，采收時(shí)期不同，即T1與T2相比，T2期部分處理SYMRK基因的相對表達(dá)量較高，其中，T2期S5增長最為明顯；但部分處理出現(xiàn)該基因表達(dá)量下降的趨勢，其中T2期S9下降最為明顯。在接種時(shí)期不同，種源和采收時(shí)期相同時(shí)，即T1、T4與T5相比，T4期各處理SYMRK基因的相對表達(dá)量總體較高，而T5期次之，T1期的各處理該基因相對表達(dá)量最小?？傮w來看，當(dāng)菌種不同時(shí)，S3、S5和S6處理更有利于根內(nèi)SYMRK基因相對表達(dá)量的增加。

2.5 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下幼苗DMI1基因表達(dá)量的變化

由圖6可知，在接種和采收時(shí)期相同時(shí)，栽培種源與野生種源相比，即T1與T3相比，除S4和S7處理外，野生種源的各處理DMI1基因的相對表達(dá)量均高于栽培種源，其中S2處理的基因表達(dá)量最高，與CK相比，存在極顯著差異。在種源和播種時(shí)期相同時(shí)，采收時(shí)期不同，即T1與T2相比，部分處理DMI1基因的相對表達(dá)量增加，其中，T2期的S7增長最為明顯，但部分處理出現(xiàn)該基因表達(dá)量下降的趨勢，其中T2期的S4下降最為明顯。在種源和采收時(shí)期相同而接種時(shí)期不同時(shí)，即T1、T4與T5相比，T4期的各處理DMI1基因的相對表達(dá)量總體較高，其中，T4期S1的DMI1基因相對表達(dá)量最大，而T1期次之，T5期的各處理該基因相對表達(dá)量最小。總體來看，當(dāng)菌種不同時(shí)，S5、S6和S9處理更有利于根內(nèi)DMI1基因相對表達(dá)量的增加。

2.6 菌根真菌與不同苗齡滇重樓共生下功能基因表達(dá)與生長發(fā)育情況的關(guān)系

綜合圖1～6結(jié)果，對S6處理方式的滇重樓功能基因表達(dá)和生長發(fā)育情況的相關(guān)性進(jìn)行分析(圖7)。栽培種源與野生種源相比，即T1與T3相比，野生種源的滇重樓菌根侵染強(qiáng)度較差，根內(nèi)ALP與SDH活性較低，而SYMRK和DMI1基因的相對表達(dá)量較大，植物基因的相對表達(dá)量除受自身遺傳因素影響外，還受外界環(huán)境因素的影響，外源接種AMF雖然促進(jìn)了野生滇重樓根內(nèi)SYMRK和DMI1基因的相對表達(dá)量增加，但其侵染強(qiáng)度較差，這說明野生滇重樓不適宜接種AMF，對于AMF與野生滇重樓的共生效應(yīng)還需深入研究。T1與T2期比較表明，當(dāng)種源和接種時(shí)期相同，采收時(shí)期延長時(shí)，滇重樓侵染強(qiáng)度、ALP與SDH活性有所增加，SYMRK基因的相對表達(dá)量增加，而DMI1略微下降，說明功能基因表達(dá)量與生長發(fā)育情況存在一定的聯(lián)系。當(dāng)接種時(shí)期不同，但種源和采收時(shí)期相同時(shí)，即T1、T4與T5相比，T4期的各指標(biāo)總體較高，說明T4期接種AMF的滇重樓生物活性較佳。

3 討 論

野生滇重樓的資源幾近枯竭，而重樓生長較為緩慢，存在育苗困難和種植周期較長等問題，影響了其商品化種植和品質(zhì)的提升。因此，尋找出滇重樓的優(yōu)勢菌株，對于提高滇重樓的品質(zhì)及后續(xù)大規(guī)模的種植滇重樓以滿足市場需求顯得十分重要。菌根化的侵染率和侵染強(qiáng)度及根內(nèi)ALP活性和SDH活性，通常被用來分析菌根真菌對宿主植物的侵染過程及其對宿主植物生長發(fā)育的貢獻(xiàn)率。本研究結(jié)果表明，外源接種AMF可與滇重樓幼苗根系形成良好的共生關(guān)系，但滇重樓對不同AMF選擇性不同，侵染率和侵染強(qiáng)度差異較大，這與周濃等[10]、張華等[11]及楊光等[18]通過對藥用植物與叢枝菌根真菌的選擇性侵染研究結(jié)果相同。SDH是標(biāo)志菌根真菌活性大小或菌根生活力的一種酶；ALP與菌絲吸收磷有關(guān)，可以直接反映叢枝菌根真菌對宿主植物有效性。與未接種株相比，菌根化滇重樓的ALP活性和SDH活性增強(qiáng)，這說明外源接種AMF與滇重樓根莖形成了狀態(tài)良好的菌根，滇重樓幼苗對AMF有著較強(qiáng)的依賴性，人工栽培過程種外源接種AMF可提高滇重樓幼苗的生命活力。

共生受體樣激酶(SYMRK)是定位于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，它對于植物感知菌根真菌并傳遞共生信號中扮演著重要的角色；產(chǎn)生鈣離子振蕩的通道蛋白基因(DMI1)位于細(xì)胞核中，對核區(qū)內(nèi)的離子傳導(dǎo)起到重要的作用[8,11]，這兩個(gè)基因所編碼的蛋白對于植物感知和接受AMF的早期信號途徑是十分重要的。與CK相比，各處理的SYMRK和DMI1基因的相對表達(dá)量都有所增加，可見AMF感染植物后誘導(dǎo)了共生基因的表達(dá)，這說明滇重樓幼苗根系在一定程度上受到了AMF的侵染。通過測定滇重樓菌根內(nèi)SYMRK和DMI1基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，野生種源的滇重樓菌根侵染強(qiáng)度以及根內(nèi)ALP與SDH活性較低，這說明與栽培種源相比，野生滇重樓不適宜接種AMF，但野生滇重樓根內(nèi)的SYMRK和DMI1基因的相對表達(dá)量較大，這說明野生滇重樓根系更易與AMF形成共生關(guān)系，植物基因的相對表達(dá)量除受自身遺傳因素影響外，還受外界環(huán)境因素的影響，對于AMF與野生滇重樓的共生效應(yīng)還需深入研究。當(dāng)種源和接種時(shí)期相同，采收時(shí)期延長時(shí)，SYMRK基因的相對表達(dá)量增加較為明顯，而DMI1基因相對表達(dá)量基本不變；種源和接種時(shí)期不同但采收時(shí)期相同時(shí)，與CK相比，各處理的基因相對表達(dá)量均高于CK，但2個(gè)基因的相對表達(dá)量存在差異，這說明滇重樓與AMF的共生受到多重因素的影響，選擇適宜的種源，在適宜的時(shí)期接種AMF能一定程度上促進(jìn)菌根的繁殖力和生命力，為滇重樓幼苗的生長發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

通過對滇重樓菌根的侵染率和侵染強(qiáng)度，以及根內(nèi)ALP活性和SDH活性的監(jiān)測，結(jié)合SYMRK和DMI1兩個(gè)基因表達(dá)量的測定，發(fā)現(xiàn)在人工栽培滇重樓的過程中，外源接種AMF可使滇重樓朝向有利于其生長發(fā)育的方向發(fā)展，最佳方案應(yīng)該是在栽培種源2年生苗期接種S6型混合菌劑，這為引種培育出高品質(zhì)的滇重樓提供了新的思路。

4 結(jié) 論

外源接種AMF可以與滇重樓幼苗形成良好的共生關(guān)系，使幼苗菌根的侵染率達(dá)到80.00%以上，其中，由Gigasporamargarita、Gigasporagigantea、Scutellosporacalospora等6種AMF組成的S6型混合菌劑的各指標(biāo)總體較高，在滇重樓2年生苗(T4時(shí)期)接種時(shí)，幼苗根莖內(nèi)的ALP和SDH活性，以及SYMRK和DMI1基因相對表達(dá)量最高，滇重樓的生物活性較佳。故本實(shí)驗(yàn)條件下，人工栽培滇重樓過程中接種AMF的最佳方案是在栽培種源2年生苗期接種S6型混合菌劑，這為引種培育出高品質(zhì)的滇重樓提供了新的思路。