基于高通量測(cè)序的草莓白粉病病原菌分析

張振榮，田云霞，董瓊娥，譚海燕，張麗芳，馮德黨，賴泳紅，楊俊譽(yù)，蘇代發(fā)，崔曉龍*，童江云*

(1.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650034；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/云南省微生物研究所，云南 昆明 650091)

【研究意義】草莓白粉病嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成極大的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失[1]，為了研究草莓白粉病病原菌種類(lèi)和寄生特性，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分析白粉病病原菌種類(lèi)，研究不同時(shí)期病原菌種類(lèi)的變化，剛離體和離體一段時(shí)間后感病組織的微生物群落變化，分析草莓白粉病病原菌多樣性情況，了解病害發(fā)生特點(diǎn)，對(duì)防治草莓白粉病有參考價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，草莓白粉病病原菌的人工分離純培養(yǎng)還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)，對(duì)草莓白粉病病原菌的鑒定主要依靠病原菌分生孢子、子囊果、附屬絲等顯微形態(tài)的觀察[2]，鮮有用高通量測(cè)序技術(shù)或ITS基因測(cè)序鑒定草莓白粉病病原菌的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)云南省昆明市3個(gè)主要栽培種冬草莓的白粉病病原菌進(jìn)行真菌多樣性分析，并將離體白粉病樣品在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)7 d，檢測(cè)長(zhǎng)出的真菌群落組成，對(duì)比病原菌群落變化，了解病原菌離體后的寄生特性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確昆明地區(qū)草莓白粉病病原菌種類(lèi)和寄生特性，為進(jìn)一步研究草莓白粉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用DNA 抽提試劑盒(FastDNA?Spin kit for Soil)從MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司處購(gòu)買(mǎi)；GeneJET 膠回收試劑盒從Thermofisher公司處購(gòu)買(mǎi)。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供MiSeq PE 300 高通量測(cè)序系統(tǒng)并進(jìn)行測(cè)序和相關(guān)操作。

1.2 樣品采集

于2019年2-4月在云南省昆明市西山區(qū)碧雞鎮(zhèn)觀音山草莓種植區(qū)(該區(qū)域常年種植冬草莓100 hm2左右)，選取草莓白粉病爆發(fā)比較嚴(yán)重的3個(gè)地點(diǎn)，編號(hào)為地點(diǎn)1、地點(diǎn)2、地點(diǎn)3。每個(gè)地點(diǎn)的草莓面積不低于300 m2，3個(gè)地點(diǎn)的草莓發(fā)病情況和取樣編號(hào)如下。

地點(diǎn)1的采樣時(shí)間是2019年2月12日，草莓品種為章姬，大棚內(nèi)地面土壤栽培，采樣時(shí)白粉病主要集中在果上，草莓植株矮小，果實(shí)小，略微干癟，白粉粉層明顯，之前用過(guò)露娜森農(nóng)藥，大棚內(nèi)高溫干燥，土壤缺水明顯。該地點(diǎn)的葉片白粉病樣品編號(hào)為ZY1，果實(shí)白粉病樣品編號(hào)為ZG1。

地點(diǎn)2的采樣時(shí)間是2019年4月29日，草莓品種為章姬，大棚內(nèi)地面土壤栽培，采樣時(shí)白粉病主要集中在果實(shí)和葉片上，葉片上新葉發(fā)病最多，新葉背面白粉粉層比正面多，草莓生長(zhǎng)狀況比較好，最近一段時(shí)間用過(guò)土壤微生物復(fù)合菌劑。該地點(diǎn)的葉片白粉病樣品編號(hào)為ZY2，果實(shí)白粉病樣品編號(hào)為ZG2。

地點(diǎn)3的采樣時(shí)間是2019年4月29日，草莓品種是紅顏和桃香，大棚內(nèi)采用基質(zhì)槽基質(zhì)栽培，其中紅顏草莓的白粉病主要集中在老葉背面上，果實(shí)上有少量白粉，取紅顏感病老葉樣品編號(hào)HY；桃香草莓的白粉病主要集中在老葉背面上，多有干赤病斑，果實(shí)上沒(méi)有白粉，取桃香感病老葉樣品編號(hào)TY。

進(jìn)行白粉病病原菌檢測(cè)的ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY共6組樣品，每組樣品包含6片以上隨機(jī)感病葉片(果實(shí))。樣品經(jīng)滅菌工具采集后，置于無(wú)菌采集袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌脫脂棉擦拭樣品表面的白粉孢子于無(wú)菌離心管中，-80 ℃保存，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

被擦拭過(guò)白粉孢子的原草莓樣品用于以下實(shí)驗(yàn)，地點(diǎn)2章姬草莓的白粉病果實(shí)和葉片(編號(hào)ZH)、地點(diǎn)3的紅顏草莓的白粉病果實(shí)和葉片(編號(hào)HL)，每個(gè)樣品隨機(jī)選取3片葉片和3個(gè)果實(shí)，在滅菌大號(hào)培養(yǎng)皿內(nèi)加入無(wú)菌水5 mL，封口膜封口，放入人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃，光強(qiáng)1500 lx，光照時(shí)間12 h·d-1[3]，培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌脫脂棉擦取表面真菌送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序。

1.3 不同草莓白粉病樣品的DNA提取及PCR擴(kuò)增

依照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品總DNA，DNA濃度和純度通過(guò)NanoDrop 2000檢測(cè)， DNA提取質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；采用引物ITS3F (5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4R (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)真菌ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]，PCR反應(yīng)體系：5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，正向與反向引物各 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，補(bǔ)無(wú)菌去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)： 95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；PCR擴(kuò)增由ABI GeneAmp?9700型PCR儀所完成。

1.4 Illumina高通量測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進(jìn)行定量，最后用MiSeq PE 300進(jìn)行測(cè)序，實(shí)驗(yàn)中的樣品均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

高通量測(cè)序的原始數(shù)據(jù)用Fastp 軟件(version 0.19.6，https://github.com/OpenGene/fastp)進(jìn)行質(zhì)控，用Flash軟件(version 1.2.11，https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)拼接， 用Uparse軟件(version 7.1，http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度下對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)并去掉單序列及嵌合體，用RDP Classifier(version 2.11，http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋，在70%閾值下利用Mothur 軟件(version 1.30.2，https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)將OTU與Unite (version 7.2，https://unite.ut.ee/)真菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[5-7]。通過(guò)樣品的稀釋曲線、物種組成、物種差異等評(píng)估不同樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性；Coverage 指數(shù)通過(guò)計(jì)算各個(gè)樣本文庫(kù)的覆蓋率反映樣本測(cè)序的深度和合理性，數(shù)值越高表明樣本中序列被檢測(cè)出的概率越高，測(cè)序結(jié)果越可靠[8]。以上分析通過(guò)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)(www.majorbio.com)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序深度分析

原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，8組樣品， ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY、ZH、HL獲得有效序列分別為71198、37793、59732、54618、54832、30558、71697和74360條。

由圖1可知，樣品的稀釋曲線已趨于飽和，即使增加測(cè)序數(shù)據(jù)深度也無(wú)法再找到更多的OTU，表明現(xiàn)有測(cè)序數(shù)據(jù)深度已合理，測(cè)序結(jié)果能全面和真實(shí)的反映所有樣本中真菌群落的多樣性[8]。

2.2 草莓白粉病病原菌種類(lèi)

如圖2所示，檢測(cè)草莓白粉病病原菌的6個(gè)樣品：ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY，白粉病病原菌多樣性分析結(jié)果基本相同，即在屬水平上群落組成分析均顯示98.8%以上是叉絲單囊殼屬Podosphaera。

2.3 離體培養(yǎng)后的兩個(gè)白粉病樣品群落組成分析

離體白粉病樣品在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)7 d后，HL(地點(diǎn)3的紅顏果實(shí)和葉片)樣品上長(zhǎng)出許多淺綠色的粉狀霉菌，群落組成分析顯示真菌菌屬為青霉屬Penicillium(88.80%)、Cladosporium(9.38%)、Acremonium(1.44%)、others(0.25%)；ZH(地點(diǎn)2的章姬果實(shí)和葉片)樣品上長(zhǎng)出許多黑色粉層的霉菌，群落組成分析顯示真菌為曲霉屬Aspergillus(86.87%)、

2.4 白粉病原菌不同樣品的真菌菌落比較分析

由表1和圖4可以看出，剛離體的6個(gè)白粉病樣品結(jié)果非常接近，物種組成非常相似，但與離體7 d后的2個(gè)樣品(HL和ZH)真菌群落組成存在顯著差異。

表1 ZY1、ZY2、ZG1、ZG2、HY、TY、HL、ZH樣品真菌群落組成(相對(duì)豐度)

3 討 論

實(shí)驗(yàn)顯示，2019年2-4月昆明地區(qū)3個(gè)冬草莓栽培種章姬、紅顏、桃香的白粉病病原菌均為叉絲單囊殼屬Podosphaera，不同草莓品種和感染部位的白粉病病原菌相同，這是首次報(bào)道中國(guó)西南地區(qū)草莓白粉病病原菌種類(lèi)。因草莓白粉病病原菌屬于專性寄生菌，目前還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)人工離體純培養(yǎng)[1]，所以暫時(shí)無(wú)法用基因測(cè)序技術(shù)鑒定到種。草莓白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera，這個(gè)結(jié)果與王佩玲等[3]在2017年用顯微鏡觀察陜西楊凌‘早紅’草莓品種鑒定草莓白粉病病原菌為子囊菌門(mén)核菌綱白粉菌目叉絲單囊殼屬的報(bào)道相同。但也有報(bào)道顯示了不同的研究結(jié)果，Pei 等[9]于2017 年首次報(bào)道，2014年4月河南商丘地區(qū)60%草莓爆發(fā)白粉病，利用ITS1/ITS4擴(kuò)增rDNA并測(cè)序，結(jié)合形態(tài)觀察鑒定當(dāng)?shù)夭葺追鄄〉牟≡鸀镚olovinomycesorontii；關(guān)玲等[10]將草莓白粉病的病原表述為子囊菌亞門(mén)真菌(Sphaerothecamacularisf.sp.Fragariae)；劉博等[11]研究發(fā)現(xiàn)，草莓白粉菌為羽衣草單囊殼[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，屬子囊菌亞門(mén)白粉菌目白粉菌科單囊殼屬，經(jīng)核對(duì)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)有誤，陳桂清等[12]并沒(méi)有羽衣草單囊殼侵染草莓或草莓屬植物，該研究叉絲單囊殼屬Podosphaera的寄主植物有薔薇科的蘋(píng)果屬、梨屬、梅屬、山楂屬、繡線菊屬、花楸屬以及樺木科的樺木屬植物上，也沒(méi)有提及草莓屬植物，說(shuō)明引用將草莓白粉病病原菌表述為羽衣草單囊殼[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，是錯(cuò)誤的。

草莓白粉病病原菌感病的部位離開(kāi)母體植株后，感染部位表面很快生長(zhǎng)出其他真菌菌落，新長(zhǎng)出的菌以青霉屬和曲霉屬為主，而原白粉病原菌不再是優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明草莓白粉病病原菌是活體營(yíng)養(yǎng)寄生菌，即病原菌只能在活的植物上生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，從活的植物組織中得到營(yíng)養(yǎng)完成生活史，一旦離體后生長(zhǎng)減弱甚至被其他菌完全覆蓋，支持了白粉菌是活體營(yíng)養(yǎng)寄生的觀點(diǎn)。同時(shí)也說(shuō)明，利用草莓葉片制作葉盤(pán)來(lái)進(jìn)行離體感染和鑒定[13]的方法可能是不科學(xué)的。此外，感染白粉病的草莓植株，一般出現(xiàn)白粉層、葉片老化和萎蔫的癥狀，很長(zhǎng)一段時(shí)間甚至整個(gè)生育期都不會(huì)死亡，可能與該病原菌的寄生特性有關(guān)，或許可以用陳相永等[14]提到的“死體營(yíng)養(yǎng)型致病菌需要通過(guò)增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的降解作用來(lái)實(shí)現(xiàn)廣譜侵染，而活體營(yíng)養(yǎng)型致病菌通過(guò)弱化植物細(xì)胞壁的降解能力來(lái)避免誘發(fā)寄主出現(xiàn)病征或死亡”加以解釋。在侵染部位方面，白粉病原菌侵染章姬品種上多個(gè)部位，果實(shí)和葉片都有，而在紅顏和桃香上，更喜歡侵染葉片，有可能跟這兩個(gè)品種的果實(shí)化學(xué)成分不同有關(guān)，比如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，草莓果實(shí)口感偏甜時(shí)更容易感染白粉病，而口感偏酸的果實(shí)很少染白粉病。

4 結(jié) 論

2019年2-4月昆明地區(qū)冬草莓栽培種的白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera，不同草莓品種和感染部位的白粉病病原菌相同，是首次報(bào)道中國(guó)西南地區(qū)草莓白粉病病原菌種類(lèi)。草莓白粉病病原菌感病的部位離開(kāi)母體植株后，感染部位表面很快生長(zhǎng)出其他真菌菌落，原白粉病原菌不再是優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明草莓白粉病病原菌是活體營(yíng)養(yǎng)寄生菌。該病原菌還表現(xiàn)出侵染周期長(zhǎng)、侵染不同品種的不同組織的特性。