鹽堿脅迫下青稞全轉(zhuǎn)錄組分析

扎 桑，王玉林，原紅軍，楊春葆，徐齊君*

(1. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850002; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850002)

【研究意義】大麥不僅是全球最早的馴化作物之一，也是世界第四大谷類作物[1]。青稞(HordeumvulgareL.,qingke)是我國(guó)青藏高原地區(qū)的大麥屬主栽作物，也稱裸大麥，占西藏糧食總產(chǎn)的 80%以上，能適應(yīng)高海拔地區(qū)干旱、寒冷、缺氧等惡劣環(huán)境，在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中積累了較多的特異強(qiáng)抗逆遺傳資源[2]。鹽堿化正在成為影響全球環(huán)境和土地資源的主要問題[3]。土壤鹽堿化會(huì)大大降低農(nóng)作物的產(chǎn)量[4-6]。研究表明，青稞對(duì)鹽脅迫的耐受能力高于普通大麥[7-8]，同時(shí)，青稞營(yíng)養(yǎng)成分豐富，兼?zhèn)浼Z食、飼料、工業(yè)原料等多種用途[9]，因而可以作為鹽堿地利用和改良的優(yōu)選作物之一。植物具有應(yīng)對(duì)不同非生物脅迫的多種防御系統(tǒng)，包括滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御、激素調(diào)節(jié)和細(xì)胞膜的脂質(zhì)飽和[10]。培育耐鹽堿品種對(duì)有效利用鹽堿化土地具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物對(duì)鹽堿的耐受性可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同代謝途徑的多個(gè)基因進(jìn)行改良。這些基因主要分為四類：第一類是滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因，如由P5CS酶合成的脯氨酸，是一種滲透保護(hù)性氨基酸[11]。第二類是離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，如擬南芥中Na(+)/ H(+)反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1，可增強(qiáng)植物的耐鹽性[12]。第三類是抗氧化相關(guān)基因，如能激活擬南芥中抗壞血酸(植物中重要的抗氧化劑)合成的AtERF98[13]。最后一類是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，如RrANR能通過(guò)調(diào)節(jié)植物響應(yīng)非生物脅迫的內(nèi)源關(guān)鍵信號(hào)因子ABA，增強(qiáng)煙草的耐受性[14]。近年來(lái)，長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA(lncRNA)已漸漸成為動(dòng)植物的重要調(diào)節(jié)因子[15]。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA MuLnc1可以通過(guò)產(chǎn)生siRNAs沉默類鈣調(diào)蛋白基因(CML27)的表達(dá)，參與桑樹的耐鹽分和干旱脅迫[16]。在擬南芥中，定位于細(xì)胞核的干旱誘導(dǎo)lncRNA(DRIR)是植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫的正向調(diào)節(jié)因子[17]。擬南芥中的Npc536通過(guò)增加初生根和次生根響應(yīng)鹽脅迫[18]。【本研究切入點(diǎn)】然而，青稞中鹽堿抗性相關(guān)的lncRNA尚未見報(bào)道。全轉(zhuǎn)錄組適合同時(shí)研究mRNA和lncRNA及其相關(guān)性。為進(jìn)一步闡明青稞基因在鹽堿脅迫中的作用，本文對(duì)2個(gè)不同鹽堿耐受青稞品種鹽堿脅迫2，8，24，48和72 h的響應(yīng)基因和lncRNAs進(jìn)行了研究。高抗鹽堿品種中特異表達(dá)的差異基因的功能富集分析表明，它們與“防御反應(yīng)”、“壓力反應(yīng)”、“離子轉(zhuǎn)運(yùn)”和“膜”相關(guān)。此外，通過(guò)lncRNA順式和反式靶基因預(yù)測(cè)構(gòu)建了lncRNA與mRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。【擬解決的關(guān)鍵問題】該研究有助于進(jìn)一步了解青稞鹽堿耐受性的機(jī)制，提高青稞對(duì)鹽堿脅迫的耐受性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取青稞耐鹽堿的0119和對(duì)鹽堿敏感的0226作為實(shí)驗(yàn)材料[19]。材料均由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料鹽堿處理 用次氯酸鈉溶液將種子滅菌15 min，用無(wú)菌水沖洗，最后在25 ℃黑暗、相對(duì)濕度60%的培養(yǎng)箱中放置2 d，使其發(fā)芽。幼苗在22/20 ℃(白天/夜晚)、14/10 h(亮/暗)光周期的溫室中生長(zhǎng)3周后，轉(zhuǎn)移至帶有蛭石栓塞的器皿中。用含150 mmol/L NaHCO3的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌鹽堿脅迫處理組的幼苗。用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌對(duì)照組幼苗。

1.2.2 總RNA提取和lncRNA文庫(kù)的構(gòu)建 取鹽堿脅迫處理2、8、24、48和72 h和相應(yīng)對(duì)照組植株的新鮮葉片，使用Trizol試劑(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國(guó))從中提取總RNA。并將總RNA中的rRNA去除來(lái)富集mRNA和非編碼RNA。加入片段化緩沖液，將mRNA和非編碼RNA片段化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化，并通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行富集。使用HiSeq 2000(Illumina)平臺(tái)對(duì)所有文庫(kù)(2個(gè)品種×3個(gè)生物學(xué)重復(fù)×2種處理×5個(gè)時(shí)間點(diǎn))分別進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生長(zhǎng)度為150 bp的雙末端測(cè)序數(shù)據(jù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對(duì)和組裝 使用fastqc(0.11.4)和fastp[20](0.12.5)對(duì)過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。首先，使用HISAT2[21](2.1.0)將過(guò)濾后的RNA-seq數(shù)據(jù)分別與青稞的參考基因組進(jìn)行比對(duì)[2]，參數(shù)設(shè)置為“置--no-mixed --no-discordant --no-”。然后使用stringtie[21](1.3.3b)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝，設(shè)置參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝，以對(duì)低覆蓋度的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾。

1.2.4 LncRNA鑒定 使用cuffcompare[22](2.2.1)將所有樣品組裝得到的轉(zhuǎn)錄本與參考注釋文件中已知的mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較[2]。保留可能是非編碼的class_code為i，j，o，u和x的轉(zhuǎn)錄本，過(guò)濾掉含單個(gè)外顯子、低reads覆蓋度以及短于200 bp的轉(zhuǎn)錄本。然后使用gffread(參數(shù)為參數(shù)為e)[23]將剩余的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換為fasta格式，并使用編碼潛能計(jì)算工具(CPC 0.9)[23]對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼潛能評(píng)估，其中使用UniRef100蛋白質(zhì)數(shù)構(gòu)建BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)。最終，CPC得分<0的所有轉(zhuǎn)錄本均被視為鑒定出的lncRNA。

1.2.5 差異表達(dá)和功能富集分析 將參考mRNA注釋文件[2]與預(yù)測(cè)的lncRNA合并成一個(gè)gtf文件，使用HTSeq (參數(shù)為“參數(shù)為“能富集分析定出的、低di)[24]分別統(tǒng)計(jì)bam文件中比對(duì)到每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)目。使用DESeq2[25](1.10.1)R包進(jìn)行差異表達(dá)分析和原始reads數(shù)目的歸一化；若滿足padj <0.05且|log2FoldChange |> 1，則被認(rèn)為是差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。使用TopGO[26](2.22.0)R包進(jìn)行GO富集分析。

1.2.6 通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù) 采用9700(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)PCR系統(tǒng)對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)，合成cDNA。采用LightCycler?480使熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche，Swiss)進(jìn)行PCR反應(yīng)，將裝有反應(yīng)液的384孔光學(xué)平板(Roche，Swiss)放入儀器中，反應(yīng)條件為：95 ℃孵育5 min，然后進(jìn)行95 ℃持續(xù)10 s和60 ℃持續(xù)30 s的40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用Primer Premier 5.0(http://www.premierbiosoft.com)設(shè)計(jì)引物，并由Invitrogen(美國(guó)卡爾斯巴德)公司合成。將基因的表達(dá)水平與GAPDH(參照)比較，用2-照)Ct方法計(jì)算其表達(dá)量[27]。

1.2.7 lncRNA靶基因預(yù)測(cè) 為鑒定反向靶基因，用R中的cor函數(shù)計(jì)算所有mRNA和lncRNA組合之間的表達(dá)相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)大于0.9的lncRNA-mRNA組合則被定義為是共表達(dá)的。用cytoscape將mRNA-lncRNA構(gòu)成的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化[28](3.6.0版)。為了鑒定順式靶基因，將位于lncRNA上游和下游5 kb內(nèi)的蛋白質(zhì)編碼基因作為lncRNA的靶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)青稞品種對(duì)鹽堿脅迫的應(yīng)答表型

脅迫48 h以前，0119和0226品種的葉片顏色差異不大(圖1)，脅迫72 h后，0226品種的黃色葉片數(shù)量明顯多于0119品種。0119品種較0226品種具有更好的鹽堿耐受性，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

2.2 青稞中l(wèi)ncRNA的全基因組鑒定

所有樣品過(guò)濾后的reads共比對(duì)到27 641個(gè)基因，占總基因數(shù)的76.5%，總體平均比對(duì)率為62.02%。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果與已知注釋數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，共鑒定出76 749種可能的新轉(zhuǎn)錄本。

用固定的流程鑒定青稞中的lncRNA，共鑒定出6704個(gè)可靠的lncRNA，其CPC得分<0。j，i，o，u和x類型的lncRNA分別代表新型、內(nèi)含子、正義、基因間和反義的lncRNA，數(shù)量分別為1104、655、826、2741和1378個(gè)。其中，基因間長(zhǎng)鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本(lincRNA)和反義長(zhǎng)鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本是lncRNA的兩大主要類型。

將lncRNA的特征與已知的mRNA進(jìn)行比較。青稞LncRNA的外顯子數(shù)量少于mRNA(圖2-A，平均分別為2.54和4.41個(gè))，但是lncRNA的外顯子長(zhǎng)度(圖2-B，平均404個(gè)核苷酸)長(zhǎng)于mRNA(平均245個(gè)核苷酸)。青稞全長(zhǎng)lncRNA轉(zhuǎn)錄本(平均長(zhǎng)度為1026個(gè)核苷酸)略短于mRNA轉(zhuǎn)錄本(平均長(zhǎng)度為1081個(gè)核苷酸，圖2-C)。

2.3 鹽堿脅迫應(yīng)答基因的鑒定

為了鑒定應(yīng)答鹽堿脅迫的基因，通過(guò)比較所有時(shí)間點(diǎn)處理樣品和對(duì)照樣品的差異獲得差異表達(dá)基因(DEG)。

在0119品種中，有463個(gè)(320個(gè)上調(diào)和143個(gè)下調(diào)，表1)、7277個(gè)(2589個(gè)上調(diào)和4688個(gè)下調(diào))、2579個(gè)(1611個(gè)上調(diào)和968個(gè)下調(diào))、7133個(gè)(2873個(gè)上調(diào)和4260個(gè)下調(diào))和8622個(gè)(3877個(gè)上調(diào)和4745個(gè)下調(diào))mRNA分別在2 、8、24、48和72 h差異表達(dá)。在0226品種中，有3587個(gè)(1844個(gè)上調(diào)和1743個(gè)下調(diào))、4795個(gè)(1943個(gè)上調(diào)和2852個(gè)下調(diào))、1699個(gè)(1003個(gè)上調(diào)和696個(gè)下調(diào))、8456個(gè)(3905個(gè)上調(diào)和4551個(gè)下調(diào))和6403個(gè)(3091個(gè)上調(diào)和3312個(gè)下調(diào))mRNA分別在2 、8 、24 、48 和72 h差異表達(dá)(圖3-A)。此外，在0119和0226品種中分別有76和233個(gè)mRNA在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)，14和56 個(gè)mRNAs在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)都下調(diào)。

表1 鹽堿脅迫下差異表達(dá)的mRNAs

在0119品種中，有78個(gè)(66個(gè)上調(diào)和12個(gè)下調(diào)，表2)、805個(gè)(299個(gè)上調(diào)和506個(gè)下調(diào))、 336個(gè)(208個(gè)上調(diào)和128個(gè)下調(diào))、883個(gè)(333個(gè)上調(diào)和550個(gè)下調(diào))和1214個(gè)(645個(gè)上調(diào)和569個(gè)下調(diào))lncRNA分別在2、8、24、48和72 h差異表達(dá)。在0226品種中，有403個(gè)(244個(gè)上調(diào)和159個(gè)下調(diào))、504個(gè)(261個(gè)上調(diào)和243個(gè)下調(diào))、176個(gè)(114個(gè)上調(diào)和62個(gè)下調(diào))、947個(gè)(509個(gè)上調(diào)和438個(gè)下調(diào))和734個(gè)(354個(gè)上調(diào)和380個(gè)下調(diào))lncRNA分別在2，8，24，48和72 h差異表達(dá)(圖3-B)。此外，在0119和0226品種中分別有8和26個(gè)lncRNA 在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)，1和5個(gè)lncRNA在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)都下調(diào)。

表2 鹽堿脅迫下差異表達(dá)的lncRNAs

隨著脅迫時(shí)間的增加，不同基因參與了脅迫應(yīng)答(圖3-C和3-D)。在2 h時(shí)，0226品種中差異表達(dá)基因的數(shù)量(3587個(gè)mRNA，403個(gè)lncRNA)明顯高于0119品種中差異表達(dá)基因的數(shù)量(463個(gè)mRNA，78個(gè)lncRNA)。因此，0226品種能比0119品種更快、更強(qiáng)的應(yīng)答鹽堿脅迫。2個(gè)品種的DEGs數(shù)量(包括mRNA和lncRNAs)均在24 h減少。DEGs數(shù)量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)說(shuō)明鹽堿脅迫應(yīng)答包含兩個(gè)階段。第一階段為滲透期，本質(zhì)上是由于細(xì)胞外部的鹽分而引起的水響應(yīng)；第二階段是離子毒性階段，由于鹽分的積累而產(chǎn)生[29]。24 h可能是兩個(gè)階段的分界點(diǎn)。

2.4 2個(gè)青稞品種中鹽堿應(yīng)答基因的比較分析

為了研究鹽堿耐受性的機(jī)制，對(duì)0119和0226品種脅迫應(yīng)答的差異基因進(jìn)行了比較(圖4-A和4-B)，上調(diào)或下調(diào)表示在鹽堿脅迫下在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因。其中，鹽堿脅迫下73.75%在0119中上調(diào)的mRNA在0226中也上調(diào)，71.30%在0119中下調(diào)的mRNA在0226中也下調(diào)。在0119品種(耐鹽堿)中，有1303個(gè)mRNA特異上調(diào)表達(dá)， 1815個(gè)mRNA特異下調(diào)表達(dá)。鹽堿脅迫下58.22%在0119中上調(diào)的lncRNAs在0226中也上調(diào)，50.82%在0119下調(diào)的lncRNAs在0226也下調(diào)。在0119品種(耐鹽堿)中，有346個(gè)lncRNA特異上調(diào)表達(dá)，346個(gè)lncRNA特異下調(diào)表達(dá)。在2個(gè)青稞品種中，超過(guò)一半的鹽堿應(yīng)答基因是共有的。

進(jìn)而對(duì)0119品種中3118個(gè)特異的DEG進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析?；騃D和GO條目的映射關(guān)系來(lái)自已發(fā)表的數(shù)據(jù)[22]。特異富集的生物學(xué)過(guò)程，包括“防衛(wèi)反應(yīng)”、“壓力反應(yīng)”、“刺激反應(yīng)”、“離子運(yùn)輸”、“金屬離子運(yùn)輸”和“陰離子運(yùn)輸”；富集的分子功能，包括“催化活性”和“蛋白激酶活性”；富集的細(xì)胞組分主要與“膜”相關(guān)(圖5-A)。對(duì)其進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)主要通路：“植物-病原體相互作用”、“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“泛素系統(tǒng)”、“復(fù)制和修復(fù)”和“ABA響應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子”。其中，脫落酸(ABA)是高鹽和干旱脅迫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[30]。

從圖4-C和4-D可知,0119品種中特異上調(diào)或下調(diào)的mRNA和lncRNA的log2 Fold Change值。脅迫2 h時(shí)，0119品種中差異表達(dá)基因較少，這些基因在脅迫8，24，48和72 h時(shí)的差異表達(dá)具有一定的時(shí)間特異性。功能富集分析表明它們可能與鹽堿耐受性有關(guān)。差異表達(dá)模式在8 和48 h以及在24 和72 h相似。

2.5 0119品種中特異DEG的功能注釋

0119品種耐鹽堿脅迫，而0226品種對(duì)鹽堿脅迫敏感。在0119品種中，有3118個(gè)特異差異表達(dá)的mRNA和798個(gè)特異差異表達(dá)的lncRNA，它們可能與鹽堿耐受性有關(guān)。根據(jù)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)3118個(gè)mRNA的功能進(jìn)行注釋(表4)，對(duì)798個(gè)lncRNA的靶基因的功能進(jìn)行注釋(表5)。其中，HVUL7H37356.2(8 和48 h上調(diào))被注釋為NHX6，屬于Na+/ H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHXs)，在Na+和K+穩(wěn)定和pH調(diào)節(jié)中起重要作用[32]。 HVUL5H41848.2(8 h上調(diào))被注釋為HKT9，HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[高K(+)親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白]介導(dǎo)Na(+)-K(+)共轉(zhuǎn)運(yùn)或Na(+)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。HVUL3H14791.2(72 h時(shí)上調(diào))和HVUL2H11056.2(42 和72 h時(shí)下調(diào))被注釋為HAK1，HVUL2H07884.2(TCONS_00057912的順式靶基因)、HVUL2H11056.2(TCONS_00073 142的順式靶基因))和HVUL4H58544.2(TCONS_00134336和TCONS_00150546的順式靶基因)被注釋為HAK家族，而HAK(高K+親和力)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要通過(guò)促進(jìn)K+轉(zhuǎn)運(yùn)提高植物的耐鹽性[33]。其次， HVUL7H33659.2(8 h時(shí)上調(diào))、HVUL2H09286.2(8 h時(shí)下調(diào))和HVUL6H08720.2(48 h時(shí)下調(diào))被注釋為APX家族，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APXs)可以保護(hù)植物免受氧化損傷[34]。HVUL6H20868.2(TC ONS_00225173的順式靶基因)被注釋為CAT2，過(guò)氧化氫酶(CAT)是一種高活性酶，可在光呼吸過(guò)程中去除過(guò)氧化氫[35]。HVUL5H36534.2(8 h下調(diào))、HVUL3H06057.2(8 h下調(diào))、HVUL6H19324.2(8 h下調(diào))和HVUL7H42896.2(48 h下調(diào))被注釋為鹽耐受性蛋白。還有幾個(gè)應(yīng)對(duì)各種脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子(TF)家族，如AP2 / ERF(APETALA2 /乙烯響應(yīng)因子)、WRKY(屬于鋅指蛋白)、NAC、MYB、bHLH(基本螺旋-環(huán)-螺旋)和bZIP(堿性域亮氨酸拉鏈)蛋白[36-37]?？傊?，0119品種中特異DEG(mRNAs)在轉(zhuǎn)錄因子家族中的分布如下：AP2 / ERF(3個(gè)上調(diào)基因，1個(gè)下調(diào)基因)、WRKY(5個(gè)上調(diào)基因，9個(gè)下調(diào)基因)、NAC(7個(gè)上調(diào)基因，10個(gè)下調(diào)基因)、MYB(8個(gè)上調(diào)基因，8個(gè)下調(diào)基因)、bHLH(2個(gè)上調(diào)基因，15個(gè)下調(diào)基因)、bZIP( 1個(gè)基因)和其他鋅指蛋白(14個(gè)上調(diào)基因， 17個(gè)下調(diào)基因)。這些TFs也可能與0119品種的耐鹽堿性有關(guān)。

2.6 鹽堿應(yīng)答lncRNA的靶基因預(yù)測(cè)

lncRNA可以順式作用于其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近，或反式作用于獨(dú)立的基因座[38]。例如，X染色體失活的特異性轉(zhuǎn)錄本(XIST)起順式作用，通過(guò)誘導(dǎo)抑制性異染色質(zhì)的形成，這是啟動(dòng)X染色體失活所必需的[39]；HOX反義轉(zhuǎn)錄RNA(HOTAIR)反式抑制位于不同染色體上的HOXD簇[40]。

0119和0226品種在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的lncRNA有2255個(gè)。通過(guò)2種策略預(yù)測(cè)這2255個(gè)lncRNA的靶基因。順式靶基因預(yù)測(cè)獲得2639個(gè)mRNA-lncRNA對(duì)，包括1685個(gè)lncRNA和2191個(gè)mRNA。反式靶基因預(yù)測(cè)獲得25 383個(gè)mRNA-lncRNA對(duì)，包括1193個(gè)lncRNA和5798個(gè)mRNA。這些mRNA中的291個(gè)與GO：0055114(氧化還原過(guò)程)相關(guān)(圖6)。此外，有 711個(gè)mRNA-lncRNA對(duì)在兩種策略中重疊。

對(duì)0119品種中特異的差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行了GO富集分析和KEGG路徑富集分析。GO富集的生物過(guò)程包括“防御反應(yīng)”、“光合作用”和“壓力反應(yīng)”，0119品種優(yōu)異的光合作用系統(tǒng)可能是其抗鹽堿性的關(guān)鍵因素；富集的分子功能包括“激酶活性”和“轉(zhuǎn)移酶活性”；細(xì)胞組分主要與“膜”相關(guān)(圖5-B)。此外，富集的KEGG通路包括“植物-病原體相互作用”、“翻譯”、“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“苯丙烷生物合成”。

2.7 基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)計(jì)算基因表達(dá)量的可靠性，利用qRT-PCR隨機(jī)挑選6個(gè)mRNA和4個(gè)lncRNA在鹽堿脅迫8、24、48 h的0119品種中進(jìn)行驗(yàn)證。6個(gè)mRNA的qRT-PCR結(jié)果和RNA-seq結(jié)果相對(duì)一致(圖7)，并且具有相似的表達(dá)模式。

4個(gè)lncRNA在選定3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的qRT-PCR結(jié)果和RNA-seq結(jié)果也一致(圖8)。說(shuō)明RNA-seq數(shù)據(jù)獲得的mRNA和lncRNA的表達(dá)模式是可靠的。

3 討 論

植物為適應(yīng)鹽度、寒冷、高溫和輻射等各種非生物脅迫，進(jìn)化出了復(fù)雜的防御機(jī)制。近年來(lái)，許多研究表明lncRNA、蛋白質(zhì)編碼基因和miRNA參與植物應(yīng)答非生物脅迫。脅迫誘導(dǎo)基因的研究不僅有助于了解脅迫耐受的分子機(jī)制，而且有助于利用基因工程培育脅迫耐受性品種[41]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，新一代代測(cè)序(NGS)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[42]。本研究中，使用RNA-seq技術(shù)全面分析了青稞鹽堿脅迫相關(guān)基因。

植物的鹽脅迫包含兩個(gè)不同的階段。在滲透階段，氣孔通過(guò)縮小孔徑的大小來(lái)平衡水分脅迫，最終導(dǎo)致光合作用速率降低，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧(ROS)積累[43]。因此，植物必須產(chǎn)生足夠的氧化還原酶，如過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)來(lái)應(yīng)對(duì)氧毒害[44]。

從60個(gè)0119和0226品種樣品中鑒定出6704個(gè)lncRNA。此外，耐鹽堿的0119品種中分別有3118和798個(gè)鹽堿脅迫差異表達(dá)mRNA和lncRNA，其功能富集包括“離子轉(zhuǎn)運(yùn)”、“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”、和“ABA響應(yīng)元件結(jié)合因子”，表明它們可能與青稞的鹽堿抗性有關(guān)。NHX(HVUL7H37356.2)、HKT(HVUL5H41848.2)和HAK(HVUL3H14791.2)基因家族雖然可以將Na+從質(zhì)膜中排出或泵入液泡中，但重要的維持離子穩(wěn)定的鹽過(guò)度敏感(SOS)信號(hào)傳導(dǎo)通路基因[46]沒在本文的DEG中。另外，2個(gè)品種中差異基因的數(shù)量在脅迫24 h減少，并且2個(gè)品種中一半以上的差異基因是共有的。耐鹽性通常由數(shù)十種生理機(jī)制和數(shù)十萬(wàn)個(gè)基因調(diào)節(jié)。 HAK，APX家族的一些基因和可能的耐鹽性蛋白或特異TF在0119品種中表現(xiàn)出相反的差異表達(dá)趨勢(shì)。鹽堿抗性相關(guān)的調(diào)控機(jī)制需要通過(guò)敲除或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

某些lncRNA可通過(guò)順式作用調(diào)控鄰近基因，而某些lncRNA可通過(guò)反式作用遠(yuǎn)程調(diào)控基因表達(dá)。預(yù)測(cè)了lncRNA的順式和反式靶基因，并根據(jù)相關(guān)的編碼基因間接預(yù)測(cè)這些lncRNA的功能，但并未通過(guò)直接捕獲與RNA相關(guān)的染色質(zhì)的CHART[46]或ChARP[47]技術(shù)預(yù)測(cè)靶基因。另外，lncRNA如何找到靶基因以及哪些蛋白質(zhì)參與該過(guò)程均不清楚。遠(yuǎn)程三維染色體結(jié)構(gòu)技術(shù)可以幫助尋找lncRNA的反式靶基因[48]。 lncRNA在遠(yuǎn)程調(diào)控基因表達(dá)中的作用可以通過(guò)染色體構(gòu)象捕獲(3C)[49]和其染色質(zhì)相互作用的衍生方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

lncRNA的序列包含潛在的轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合位點(diǎn)，并且TF與lncRNA之間的相互作用可能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在擬南芥中，光敏色素相互作用因子(PIF)脅迫相關(guān)的TF可能在強(qiáng)光下正向和負(fù)向調(diào)節(jié)lncRNA的表達(dá)[50]。 lncRNA也可能與TF相互作用，促進(jìn)靶基因的表達(dá)[51]。 RNA蛋白質(zhì)相互作用的RNA免疫沉淀(RIP)[52]、交聯(lián)和免疫沉淀(CLIP)[53]方法可用于研究與lncRNA結(jié)合的TF。從另一個(gè)角度看，RNA-RNA相互作用也有助于lncRNA功能的研究，如補(bǔ)骨脂素對(duì)RNA相互作用和結(jié)構(gòu)的分析(PARIS)[54]，連接相互作用的RNA的高通量測(cè)序(LIGR-seq)[55]和補(bǔ)骨脂素交聯(lián)、連接和選擇雜交(SPLASH)[56]的技術(shù)。

lincRNA和miRNA在調(diào)節(jié)防御相關(guān)基因表達(dá)的過(guò)程中存在復(fù)雜的交互作用。在毛果楊(Populustrichocarpa)中，一些lincRNA被認(rèn)為是miRNA的靶基因而發(fā)揮功能[57]。同樣，lncRNA被鑒定為應(yīng)答番茄病毒感染的miRNA的靶基因[58]。但是，本文中并未對(duì)lncRNA作為miRNA的靶基因進(jìn)行研究。因此，需要整合更多的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析lncRNA功能。