高效液相色譜法測(cè)定肥料中3，4-二甲基吡唑磷酸鹽的方法研究

保萬魁，黃均明，韓巖松，劉 蜜，劉紅芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

通過在氮肥或其施用過程中添加硝化抑制劑和脲酶抑制劑（統(tǒng)稱為肥料增效劑［1-2］）來降低土壤脲酶、土壤亞硝酸細(xì)菌活性，從而減少氮損失，是提高氮肥利用率的重要途徑之一。

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）是國(guó)內(nèi)外研究較多的一種新型硝化抑制劑。DMPP 分子式為C5H8N·H3PO4，灰白色粉狀物質(zhì)，分子量為194.2，熔點(diǎn)165℃，密度1.51 g/cm3（20℃），水中溶解度為132 g/L，pH 值為2.5～3.0，蒸汽壓小于10-4Pa（20℃）［2］。作為硝化抑制劑，其可以和銨態(tài)氮肥及能產(chǎn)生銨態(tài)氮的酰胺態(tài)氮肥尿素等混合使用。許多試驗(yàn)表明，DMPP 在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高作物氮肥利用率、減少環(huán)境污染方面的作用效果顯著［3-12］。同時(shí)，與其它硝化抑制劑相比，DMPP 還具有用量小、抑制效果好、對(duì)土壤和作物均沒有毒害的優(yōu)點(diǎn)，并且在土壤中降解慢，抑制時(shí)間較長(zhǎng)，遷移性小，不易與土壤剖面中的銨態(tài)氮分離［13-14］。因具有上述諸多獨(dú)特效果，DMPP 在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用也日益廣泛［3］。目前已在中國(guó)、澳大利亞、比利時(shí)、法國(guó)、德國(guó)、意大利、西班牙和新西蘭等多個(gè)國(guó)家注冊(cè)［2，4，15-16］。

然而，DMPP的作用效果在不同環(huán)境條件下存在一定的波動(dòng)性。其硝化抑制效率的高低、有效作用期的長(zhǎng)短及施用效果，均受到用量和施用形式、土壤質(zhì)地、環(huán)境溫度、土壤水分、土壤酶活性、土壤酸堿狀況等多因素的綜合影響［10，17］。因此，有研究者認(rèn)為DMPP 硝化抑制效果不如氯甲基吡啶［18］，或DMPP 對(duì)農(nóng)產(chǎn)品沒有明顯的增產(chǎn)效果［8］。雖然施用DMPP 顯著減少了溫室氣體N2O 和CO2的排放量，但是增加了氨的揮發(fā)［13］。

可以看出，作為硝化抑制劑的DMPP 必須科學(xué)、適量使用才能達(dá)到預(yù)期效果和最佳效益。而準(zhǔn)確定量測(cè)定是做好此類產(chǎn)品生產(chǎn)、管理和施用的關(guān)鍵。近年來，DMPP 在我國(guó)的應(yīng)用越來越多，但國(guó)內(nèi)關(guān)于DMPP 測(cè)定方法的研究很少，有個(gè)別涉及氣相色譜法測(cè)定土壤和緩釋尿素中DMPP 含量的報(bào)道，采用內(nèi)標(biāo)法，操作相對(duì)繁瑣［19-20］，而國(guó)內(nèi)關(guān)于液相色譜法測(cè)定肥料中DMPP 含量的研究未見報(bào)道。因此，研究建立肥料中DMPP 含量測(cè)定的方法顯得十分必要，研究結(jié)果將為此類產(chǎn)品生產(chǎn)控制、質(zhì)量監(jiān)督、市場(chǎng)監(jiān)管，尤其是科學(xué)施用等工作提供檢測(cè)手段，并在一定程度上為推動(dòng)肥料產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)參考。歐盟于2012 年出臺(tái)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)“Fertilizers-Determination of 3，4-dimethyl-1H-pyrazole phosphate（DMPP）-Method using high-performance liquid chromatography（HPLC）”（EN 16328：2012），該方法適用于礦質(zhì)氮肥，且固定的稱樣量（30 g）和較窄的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍等具體操作決定了其主要針對(duì)目標(biāo)物含量相對(duì)單一的樣品測(cè)定。但根據(jù)肥料增效劑和增效氮肥在我國(guó)的發(fā)展和應(yīng)用實(shí)際，需要面對(duì)的樣品不僅僅是礦質(zhì)氮肥，還包括純DMPP 硝化抑制劑產(chǎn)品、添加DMPP的有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥料、有機(jī)肥料以及多種原料混合的肥料樣品等，因此，本文在參考上述歐盟方法儀器條件的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)就目標(biāo)物提取、方法線性和穩(wěn)定性，以及不同原料的可能影響等方面進(jìn)行研究，力求建立適用于目標(biāo)物含量變化范圍寬、樣品種類和基體復(fù)雜多樣等具體實(shí)際的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

除另有說明外，本方法中所用試劑為色譜純，水符合GB/T 6682 中一級(jí)水要求。

乙腈；

一水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O），分析純；

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.5%，在-20℃條件下貯存；

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：ρ（DMPP）=1000 mg/L。準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.0001 g）3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL 容量瓶中，加入50 mL 水并振蕩至完全溶解后，用水定容。

1.2 儀器和設(shè)備

Waters2695 高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；AS 系列超聲波清洗器；JRA-604C 恒溫振蕩器；BSA224S 型電子天平（精度0.0001 g）；微孔濾膜：0.45 μm，水系。

1.3 供試樣品

樣品包括搜集的肥料和DMPP 產(chǎn)品，以及自制的樣品共若干個(gè)。

1.4 分析步驟

1.4.1 試樣的制備

固體樣品縮分至約100 g，將其迅速研磨至全部通過0.50 mm 篩（如樣品潮濕，可通過1.00 mm篩），混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中；液體樣品經(jīng)搖動(dòng)均勻后，迅速取出約100 mL，置于潔凈、干燥的容器中。

1.4.2 試樣溶液的制備

稱取0.1～3 g（精確至0.0001 g）混合均勻的試樣于250 mL 容量瓶中，加約200 mL 水，塞緊瓶塞，搖動(dòng)容量瓶使試料分散，置于常溫振蕩器內(nèi)，在180 r/min 頻率下振蕩后用水定容并搖勻，過微孔濾膜后待測(cè)。

1.4.3 儀器條件

——色譜柱：C18，5 μm，150 mm×4.6 mm（長(zhǎng)×直徑），或相當(dāng)者；

——流動(dòng)相：將1.38 g 一水合磷酸二氫鈉溶于1 L 水中，加入175 mL 乙腈，脫氣；

——流速：1.5 mL/min；

——柱溫：室溫；

——進(jìn)樣量：10 μL；

——檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取DMPP 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mL 于6 個(gè)10 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度分別為0、20、50、100、200、300 mg/L。過微孔濾膜后，按濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 試樣溶液的測(cè)定

將試樣溶液或經(jīng)稀釋一定倍數(shù)后，在與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相同的條件下測(cè)定，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的質(zhì)量濃度（mg/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

在其他分析條件保持一致的條件下，參考相關(guān)方法的提取條件［21］，在常溫下分別選擇超聲和180 r/min 頻率下振蕩兩種方式，用不同時(shí)間處理樣品，其中D1 由復(fù)混肥料樣品添加DMPP 制得，D2 由有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥料樣品添加DMPP 制得。所測(cè)結(jié)果見表1。

表1 不同提取條件對(duì)DMPP 測(cè)定結(jié)果的影響

結(jié)果表明，所選兩個(gè)樣品在振蕩15 min 條件下測(cè)定結(jié)果略低，而在其他提取方式、時(shí)間的比較之間沒有明顯差別。但因樣品均勻性和代表性需要，實(shí)驗(yàn)人員往往選擇適當(dāng)增大稱樣量的做法，為保證這種情況下試樣的提取完全，以及從通常實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件和實(shí)驗(yàn)提取效率考慮，確定選擇常溫振蕩30 min的前處理?xiàng)l件。以下實(shí)驗(yàn)均按此條件進(jìn)行樣品前處理。

2.2 線性范圍、回歸方程、檢出限和精密度

在實(shí)驗(yàn)確定的分析條件下，對(duì)一系列濃度的3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，3，4-二甲基吡唑磷酸鹽在0.1～1000 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以3，4-二甲基吡唑磷酸鹽質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積y 為縱坐標(biāo)（圖1），得出回歸方程y=7.21×103x+8.08×103（R2=0.9999）。對(duì)空白進(jìn)行11 次測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，求得檢出限，結(jié)果為0.004 mg/L。

隨機(jī)選取一份樣品，稱取7 份試樣進(jìn)行平行測(cè)定，用以考察實(shí)驗(yàn)方法精密度。7 次平行測(cè)定平均值為76.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%。

2.3 穩(wěn)定性

用確定的實(shí)驗(yàn)方法，隨機(jī)選取不同DMPP 含量的數(shù)個(gè)樣品，前后間隔30 d 分別進(jìn)行兩次DMPP含量測(cè)定，考察方法穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。測(cè)定值1 和測(cè)定值2 分別為不同時(shí)間兩次平行測(cè)定結(jié)果的算數(shù)平均值。結(jié)果顯示，用該方法對(duì)間隔34 d的樣品重新測(cè)定，結(jié)果一致性很好，這說明該方法穩(wěn)定性良好。

表2 DMPP 測(cè)定方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （%）

2.4 不同氮肥原料對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

為驗(yàn)證與3，4-二甲基吡唑磷酸鹽可配合使用的氮肥原料對(duì)其測(cè)定結(jié)果是否有影響，選擇氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、尿素硝酸銨溶液以及復(fù)混肥料等樣品，用加標(biāo)法測(cè)定回收率，結(jié)果見表3。

從表3 看出，供試樣品中DMPP 回收率兩次平行測(cè)定結(jié)果一致性很好，且兩次測(cè)定平均值均在97.9%～101.4%范圍內(nèi)。另外，實(shí)驗(yàn)過程中通過觀察發(fā)現(xiàn)DMPP 色譜圖峰形均很好（圖2，圖3），這說明與DMPP 可配合使用的氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素等氮肥原料及其不同組合（如尿素硝酸銨溶液和復(fù)混肥料），以及部分有機(jī)物料和NBPT、NPPT 等均不會(huì)干擾DMPP的定量測(cè)定。更進(jìn)一步說明，不同氮形態(tài)以及氮、磷、鉀的混合均不對(duì)DMPP 測(cè)定造成干擾。

表3 不同原料對(duì)3，4-二甲基吡唑磷酸鹽測(cè)定結(jié)果的影響 （%）

3 結(jié)論

通過樣品前處理?xiàng)l件、方法線性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等實(shí)驗(yàn)研究，建立了一種外標(biāo)法測(cè)定DMPP含量的高效液相色譜儀方法。結(jié)果顯示這種方法的精密度、準(zhǔn)確性等方法性能指標(biāo)均能滿足檢驗(yàn)的要求。方法在0.1～1000 mg/L 范圍內(nèi)線性良好（R2=0.9999），回收率均在97.9%～101.4%之間。同時(shí)，該方法具有前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、干擾因素少、方法穩(wěn)定且結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適合DMPP產(chǎn)品及不同肥料中DMPP 含量的批量測(cè)定。此方法的建立將為我國(guó)此類產(chǎn)品生產(chǎn)、流通和使用等環(huán)節(jié)的管理實(shí)踐提供參考技術(shù)手段，也將在一定程度上為推動(dòng)肥料產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供基礎(chǔ)支撐。