穩(wěn)定過表達TFF1對MHCC97H細胞增殖、侵襲、轉移及EMT發(fā)生的影響①

李亞光 鄧同興 趙克芳 馬廣耀 郭文濤（漯河醫(yī)學高等?？茖W校解剖教研室，漯河462000）

原發(fā)性肝癌是世界上常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，每年約有84萬新診斷病例［1-2］。肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主要的原發(fā)性肝癌，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%［3］。由于大多數(shù)患者無法早期診斷，很多HCC患者確診時已經是中晚期。HCC的惡性程度高、進展快、侵襲性強、確診病程晚、整體預后差等特征使其成為腫瘤防治工作的難點。早期準確診斷肝癌可顯著提高臨床療效，減輕患者痛苦。然而，臨床技術如影像學和組織學方法只能檢測相對晚期的HCC患者［4］。因此，迫切需要新的、可靠的生物標志物為臨床診治提供依據(jù)。

哺乳動物三葉因子（trefoil factor，TFF）家族由3個7～12 kD蛋白酶抗性肽組成，該家族蛋白具有6個半胱氨酸殘基的獨特高度保守基序，即所謂的三葉結構域［5］。目前三葉因子1（trefoil factor 1，TFF1）在腫瘤中的作用仍存在爭議。TFF1最初在乳腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，在不同的腫瘤組織（結腸癌、胰腺和卵巢）中，TFF1的異常表達與刺激細胞增殖、遷移、侵襲性和腫瘤擴散相關［6-9］。最近研究報道顯示在胃癌中TFF1可以作為一種腫瘤抑制基因［10］。這些結果提示TFF1可能是一種新的腫瘤標志物。然而TFF1在肝癌中的表達情況及其過表達后對HCC細胞MHCC97H生物學行為的影響目前未見報道。本研究利用慢病毒載體使HCC細胞MHCC97H中TFF1過表達，進一步探討細胞生物學行為的變化，以期為肝癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC細胞系MHCC97H購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；慢病毒載體LV5-GFP購自上海吉瑪制藥技術有限公司；TRIzol試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Matrigel膠購自美國BD Biosciences公司；PCR引物為廣州華大基因公司設計合成；TFF1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、GAPDH抗體購自美國ProteinTech Group公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標記的二抗、ECL發(fā)光試劑購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 TFF1與肝癌的臨床關聯(lián)分析 肝癌組織中TFF1表達的臨床數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga），利用該數(shù)據(jù)庫分析TFF1在肝癌組織和正常組織中的表達。另取來源于漯河醫(yī)專第一附屬醫(yī)院32例肝癌組織和癌旁正常組織樣本，樣本收集于2017年1月至2019年8月，患者術前未經放、化療和免疫治療。熒光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測不同組織中TFF1 mRNA的表達。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染 將MHCC97H細胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM中。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將TFF1的cDNA序列克隆到慢病毒載體LV5-GFP中。使用293T細胞進行慢病毒包裝，72 h后收集病毒上清，經0.45 μm過濾器過濾用于感染MHCC97H細胞。收集處于對數(shù)生長期的MHCC97H，制備成5×104個/ml的懸液。將細胞以2 ml/孔接種到6孔板中。24 h后用慢病毒（1×108TU/ml）感染，感染后用嘌呤霉素（2 μg/ml）處理細胞72 h以篩選陽性克隆，用熒光顯微鏡觀察陽性細胞。感染TFF1慢病毒的細胞為過表達組（overexpression TFF1 group，oe-TFF1組）；同時用不含TFF1的慢病毒感染細胞作為陰性對照組（negative control group，NC組）；用未轉染的細胞作為空白組（Blank組）。

1.2.3 qRT-PCR檢測TFF1表達 使用TRIzol試劑提取肝癌組織和細胞中的總mRNA。紫外可見分光光度法確定濃度后，使用PrimeScript RT試劑將RNA反轉錄為cDNA。用獲得的cDNA作為模板，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。引物序列為：TFF1上游引物：5'-TGGGTTTTGGTTAGGGTGTT-3'；TFF1下游引物：5'-CTCATCCCTAACTCAAAATCA-3'；GAPDH上游引物：5'-CGAGATCCTCAACCAATCAA-3'，下 游 引 物：5'-GGTGGTCCAGGGTCGTTACT-3'。PCR反應條件：95℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，重復40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用相對定量（2-ΔΔCt法）計算靶基因相對表達量。

1.2.4 Western blot分析 收集細胞，提取各組細胞總蛋白，用PBS洗滌，在含有蛋白酶和堿性磷酸酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液中裂解30 min。提取各組總蛋白，用BCA法進行定量。蛋白質通過10%SDSPAGE電泳分離，轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，用稀釋的一抗（TFF1 1∶1 000、E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000、Vimentin 1∶1 000、GAPDH 1∶2 000）在4℃孵育過夜。TBST洗滌3遍后，將膜與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的二抗孵育1 h。TBST洗膜3遍，將膜與增強的化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑一起孵育，X光片曝光成像。使用ImageJ軟件分析灰度值，并根據(jù)目標蛋白條帶與GAPDH條帶的灰度值之比計算目標蛋白相對表達水平。

1.2.5 遷移實驗 用胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2遍，用無血清培養(yǎng)基將細胞制備成懸浮液，密度調整為1×105個/ml。將150 μl細胞懸液添加到Transwell頂端腔室中，并將500 μl含20%血清的培養(yǎng)基添加到基底外側腔室中。48 h后，將腔室移出并用無菌PBS洗滌。用棉簽小心地擦拭微孔膜內層中的細胞，95%乙醇固定6 min，然后用4 g/L結晶紫溶液染色。在倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.2.6 侵襲試驗 將Matrigel膠用DMEM以1∶9的比例稀釋并加入上室中。凝膠凝固后，將含有10%FBS的500 μl DMEM加入到24孔板中，并將細胞密度調整為1×105個/ml，按照遷移實驗方法進行后續(xù)實驗。

1.2.7 CCK-8試驗 將細胞在96孔板（3×103個/孔）中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h。除去培養(yǎng)基，向各孔中加入100 μl含10%FBS的DMEM和10 μl CCK-8測定緩沖液。孵育4 h后，在450 nm處測定吸光度（OD）值。繪制細胞生長曲線。

1.2.8 集落形成實驗 將細胞500個/孔接種到6孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，用PBS輕輕洗滌孔2次。75%乙醇固定后在室溫下用0.1%結晶紫染色10 min。PBS洗滌并使其自然干燥，然后拍攝集落并計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，t檢驗和單因素方差用于分析實驗結果和生物信息學數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TFF1在肝癌患者中的表達 根據(jù)TCGA中的臨床信息，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，肝癌組織中TFF1的表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（圖1A，P＜0.05）。通過qRT-PCR分析臨床樣本，結果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，TFF1 mRNA的表達水平在肝癌組織中顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（圖1B，P＜0.05）。

圖1 TFF1在肝癌組織和正常組織中的表達Fig.1 Expression of TFF1 in human hepatoma and normal tissues

2.2 慢病毒介導TFF1在MHCC97H細胞中高表達為了研究TFF1在肝癌中的作用，通過將慢病毒介導的TFF1轉染到MHCC97H細胞中。感染后3 d通過熒光顯微鏡觀察到超過90%的細胞表達GFP，這表明慢病毒載體成功感染了MHCC97H細胞（圖2A）。qRT-PCR結果表明與用空載體轉染的細胞相比，TFF1轉染成功的細胞中TFF1 mRNA的表達水平顯著增加（圖2B，P＜0.01）。Western blot結果顯示與對照相比，TFF1轉染成功的細胞中TFF1蛋白表達水平也顯著升高（圖2C、D，P＜0.01）。結果表明成功獲得了穩(wěn)定高表達TFF1的MHCC97H細胞。

圖2 慢病毒介導外源性TFF1在MHCC97H細胞中過表達Fig.2 Establishment of TFF1-overexpression MHCC97H cell line

2.3 TFF1過表達對MHCC97H細胞增殖和集落形成能力的影響 慢病毒介導TFF1過表達后，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，oe-TFF1組細胞的增殖明顯受到抑制（圖3A）。集落形成實驗表明，在慢病毒感染MHCC97H細胞14 d后，oe-TFF1組細胞集落形成降低（圖3B、C，P＜0.01）。這提示TFF1的過表達抑制了MHCC97H細胞的增殖和集落形成能力。

圖3 TFF1過表達對MHCC97H細胞增殖的影響Fig.3 Effect of TFF1 overexpression on cell proliferation

2.4 TFF1過表達對MHCC97H細胞遷移與侵襲能力的影響 遷移實驗表明，接種48 h后，與對照組相比，oe-TFF1組MHCC97H細胞遷移穿膜的數(shù)量為101.67±4.087，與對照組（135.83±3.87）相比顯著減少（圖4A、B，P＜0.01），表明TFF1過表達能抑制MHCC97H細胞的遷移能力。侵襲實驗表明與對照組相比，TFF1的過表達可以減少MHCC97H細胞通過Matrigel膠的細胞數(shù)量（圖4C、D，84.5±1.87 vs 109.5±4.28，P＜0.01）。說明過表達TFF1表達能抑制MHCC97H細胞的侵襲能力。

圖4 TFF1過表達抑制MHCC97H細胞遷移和侵襲Fig.4 Overexpression of TFF1 attenuated migration and invasion of MHCC97H cells

2.5 TFF1過表達對MHCC97H細胞EMT的影響Western blot檢測TFF1過表達后上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）和人波形蛋白（Vimentin）的表達水平。結果顯示與對照組相比TFF1過表達組細胞中E-Cadherin表達增高，與之相反，Vimentin和N-Cadherin則在oe-TFF1組表達下降（圖5）。這提示細胞EMT進程因TFF1過表達而被抑制，進而抑制HCC細胞的侵襲與遷移能力。

圖5 TFF1過表達對EMT蛋白表達的影響Fig.5 Effect of TFF1 overexpression on expressions of EMT-related proteins

3 討論

TFF基因定位21號蛋白，該家族蛋白均含有一個或幾個三葉因子結構域，該結構域結構特殊、穩(wěn)定性強，使得TFF家族蛋白有著耐熱、耐酸和耐蛋白酶水解的理化特質。TFF1是三葉因子之一，作為一種分泌蛋白，在多種組織中均有表達，但主要高表達于胃腸道內，發(fā)揮著胃腸道黏膜屏障和修復的生理功能［11］。TFF1能夠與黏蛋白結合發(fā)揮保護胃腸道的功能，同時還能夠促進黏膜重建。TFF1在其他器官如回腸、結腸、唾液腺、胰腺、呼吸道、乳房和肝臟中均有表達，在其他部位的組織再生中發(fā)揮作用［12-13］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)TFF1在腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)TFF1在胃癌中表達水平降低，TFF1敲除后小鼠更容易發(fā)生胃癌［14-15］。胃作為TFF1的主要表達器官，在發(fā)揮促進組織再生的同時也作為一種腫瘤抑制因子存在。但是在結腸、乳腺、胰腺和前列腺腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)TFF1表達水平升高，能夠刺激細胞存活、遷移、侵襲性以及腫瘤擴散，表明TFF1是一種潛在的腫瘤標志物［7-9］。在肝臟中發(fā)現(xiàn)受損肝細胞TFF1表達較弱。大多數(shù)肝癌是在肝炎和肝硬化基礎上發(fā)生的，而肝炎和肝硬化都是需要再生的肝損傷，肝細胞中的TFF1在肝癌發(fā)生的早期可能具有促進肝再生或者抑制肝癌發(fā)展的作用，TFF1在肝癌中的功能有待進一步研究。

肝癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，TFF1在肝癌中的作用和功能報道較少。本研究根據(jù)TCGA中的臨床信息，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，肝癌組織中TFF1的表達降低。利用慢病毒介導使TFF1在MHCC97H細胞中過表達，CCK-8實驗和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，TFF1的過表達抑制了MHCC97H細胞的增殖和集落形成能力。遷移和侵襲實驗表明過表達TFF1能抑制MHCC97H細胞的遷移、侵襲能力。這些結果提示TFF1可能也是肝癌的一種潛在腫瘤標志物，參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

EMT是細胞失去其上皮特性而獲得間充質特征的過程，已被證明是癌癥進展的重要步驟。在EMT期間，上皮細胞失去細胞極性以及與基底膜鏈接等上皮表型，改變細胞骨架結構并增加其運動性，所有這些均導致侵襲性表型［16-17］。EMT后的腫瘤細胞可以離開腫瘤塊并遷移到周圍的正常組織中，從而導致這些腫瘤的局部進展［18］。此外，EMT會增加腫瘤細胞侵襲血管以及向新組織中上皮層的遷移，導致遠處轉移的發(fā)生率更高，腫瘤患者的預后更差［19］。EMT的特征是上皮標志物的表達降低同時間充質相關蛋白的表達升高，其中E-鈣黏蛋白的下調和N-鈣黏蛋白和/或波形蛋白的上調為EMT的典型標志［20］。本研究發(fā)現(xiàn)TFF1過表達后引起HCC細胞中E-Cadherin表達增高，與之相反，Vimentin和N-Cadherin則表達降低。結果提示EMT進程因TFF1過表達而被抑制，進一步導致HCC細胞侵襲與遷移能力的降低。TFF1在HCC的侵襲、轉移過程中可能發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，通過使TFF1在人HCC細胞MHCC97H中過表達，能夠抑制細胞增殖、侵襲、遷移以及EMT的能力。這表明TFF1可能是HCC發(fā)生的一種抑制因子，可作為一種新的腫瘤標志物。鑒于TFF1作為一種分泌蛋白，利用TFF1治療肝癌有可能成為一種新的肝癌治療策略。