IL-1β基因修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究①

徐楊超 賴 青 吳 堅(jiān) 汪 煒 鄭 敏（江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，上饒334000）

急性肝衰竭是由病毒、酒精、藥物等多種病因引起的大量肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致的肝功能障礙與失代償［1-2］，其有效治療方法為原位肝移植，但由于存在供體短缺、排斥反應(yīng)、價(jià)格較貴與疾病進(jìn)展較快等問題限制了其臨床應(yīng)用。隨著干細(xì)胞學(xué)、肝細(xì)胞再生與免疫學(xué)方面研究的深入開展，使得再生醫(yī)學(xué)臨床治療終末期肝病成為可能。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC）是一類具有多向分化潛能、免疫調(diào)控功能與自主更新能力的干細(xì)胞，可被誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞，參與細(xì)胞的趨化與黏附，發(fā)揮抗纖維化與免疫調(diào)節(jié)作用來治療肝臟疾?。?-5］。通過搭載目的基因以強(qiáng)化或改善ADSCs功能活性，增強(qiáng)其對急性肝臟衰竭的保護(hù)作用，對進(jìn)一步發(fā)掘ADSCs的作用和價(jià)值意義重大。作為IL-1的主要形式，IL-1β對肝細(xì)胞具有保護(hù)作用［6］。因此本實(shí)驗(yàn)主要觀察IL-1β基因修飾的ADSCs移植治療急性肝衰竭的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物6周齡健康雄性SD大鼠57只，體重（210±15）g，SPF級，其中54只用于急性肝衰竭模型的建立，另外3只用于ADSCs的分離培養(yǎng)。將所有動物飼養(yǎng)于18～25℃，相對濕度40%～60%的環(huán)境中，12 h/12 h明暗交替，自由進(jìn)食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 戊巴比妥鈉（57-33-0，上海氟德化工有限公司）；胎牛血清、DMEM完全培養(yǎng)（百恩維生物科技有限公司）；IL-1β（I2393-10UG，Sigma-Aldrich）；D-氨基半乳糖（化夏化學(xué)北京公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0（吉凱基因有限公司）；熒光顯微鏡（BX43，南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司）；流式細(xì)胞儀（RZ，上海然哲儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng)［7］腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，備皮后在腹部做1個十字切口，皮下游離至腹股溝，獲取脂肪組織約2 g，以含雙抗的PBS清洗3次；將剪碎的脂肪組織分裝入50 ml離心管內(nèi)，以1∶2比例加入0.075%的Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃條件下80 r/min水浴振蕩60 min；按照膠原酶的量加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，1 500 r/min離心11 min后去上清，將5 ml紅細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞沉淀中裂解5 min。PBS清洗后經(jīng)細(xì)胞篩過濾，隨后轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)1 500 r/min離心5 min，去上清，以含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。約24 h后細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)基，此后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)到約80%時(shí)，以1∶2比例傳代。取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ADSCs的鑒定 將第3代ADSCs以胰酶消化后計(jì)數(shù)，利用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×106的細(xì)胞密度加入流式管內(nèi)，分別加入FITC標(biāo)記的流式抗體CD29、CD34、CD45、CD49d、CD90，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。

1.2.3 IL-1β體外誘導(dǎo)ADSCs的分化 將第3代ADSCs以1×105個/孔接種于置有細(xì)胞爬片的6孔板，細(xì)胞貼壁24 h后分4組：分別加入20 μg/L肝細(xì)胞生長因子（HGF組）、20 μg/L肝細(xì)胞生長因子+5 μg/L IL-1β（HGF+5IL-1β組）、20 μg/L肝細(xì)胞生長因子+10 μg/L IL-1β（HGF+10IL-1β組）、20 μg/L肝 細(xì) 胞 生 長 因 子+20 μg/L IL-1β（HGF+20IL-1β組），各組均加入10%胎牛血清。待細(xì)胞爬片達(dá)到90%時(shí)換液，加入2 ml含對應(yīng)誘導(dǎo)因子的L-DMEM培養(yǎng)基，每3 d換液1次。誘導(dǎo)分化21 d內(nèi)進(jìn)行免疫組化染色，利用Imagepro plus圖像處理系統(tǒng)分析白蛋白與角蛋白陽性表達(dá)率。

1.2.4 ADSCs的基因修飾 根據(jù)大鼠IL-1β基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，F(xiàn)：5'-GCGTTTAAACATGCACAGCTCAGCCACTG-3'，R：5'-GCGTTTAAACTCAGTTTCGTATCTTCAT-3'。PCR擴(kuò)增獲取目的基因片段后，利用限制性內(nèi)切酶酶切工具載體GV358，將其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶后獲得線性化載體，將線性化載體與目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)線性化載體和目的基因片段的體外環(huán)化，獲得慢病毒表達(dá)載體IL-1β-Lv-GV358。將10 μl慢病毒表達(dá)載體IL-1β-Lv-GV358與100 μl感受態(tài)細(xì)胞DH5α混合均勻，進(jìn)行單克隆PCR鑒定與測序，獲得高純度的慢病毒質(zhì)粒IL-1β-Lv-GV358。將慢病毒質(zhì)粒IL-1β-Lv-GV358與輔助包裝質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清液；4℃、4 000 g離心10 min，上清液以0.45 μm濾器過濾，置于40 ml超濾離心管中4℃、25 000 r/min離心2 h，收集沉淀并加入病毒保存液重懸。沉淀溶解后10 000 r/min離心5 min，收集慢病毒上清液并分裝。采用熒光法檢測病毒滴度。將第3代ADSCs以5×104個/孔接種于96孔板，加入100 μl完全培養(yǎng)基后置于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到30%融合時(shí)棄原培養(yǎng)液，以感染復(fù)數(shù)=100進(jìn)行轉(zhuǎn)染，向各孔中加入10 μl病毒液、10 μl Ploybrene增強(qiáng)液和80 μl完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。12 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，Western blot法檢測IL-1β蛋白表達(dá)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動物分組與干預(yù) 將54只SD大鼠隨機(jī)分3組，分別為模型組、未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組，18只/組。3組均建立急性肝衰竭模型。急性肝衰竭模型的建立：腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹腔注射1 400 mg/kg D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭大鼠模型［8］。病理觀察驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)造模成功。將慢病毒IL-1β-Lv-GV358轉(zhuǎn)染的ADSCs與未轉(zhuǎn)染的ADSCs分別置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)棄掉培養(yǎng)基，加入CM-Dil熒光標(biāo)記液孵育20 min，進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。造模24 h后，轉(zhuǎn)染組尾靜脈注射1 ml慢病毒IL-1β-Lv-GV358轉(zhuǎn)染的ADSCs，未轉(zhuǎn)染組尾靜脈注射1 ml ADSC，模型組尾靜脈注射1 ml生理鹽水，兩治療組移植的細(xì)胞數(shù)為1×106個。

1.2.6 檢測指標(biāo)

1.2.6.1 肝功能檢測 移植后24 h、48 h、72 h每組隨機(jī)取大鼠6只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，內(nèi)眥靜脈取血1 ml后置于EP管內(nèi)，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素濃度。嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作。

1.2.6.2 肝臟病理分析 移植后24 h、48 h、72 h采集血清后取部分肝組織，進(jìn)行石蠟包埋，切片（切片厚度約4 μm），常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肝臟炎癥與壞死情況。利用HAI評分系統(tǒng)對肝臟組織炎癥壞死程度進(jìn)行計(jì)分，該評分系統(tǒng)分別按界面性炎癥及橋接壞死的程度按0～10分評定；按小葉內(nèi)肝細(xì)胞變性和壞死范圍及匯管區(qū)的炎癥狀況分別記為0～4分，按纖維化的程度分別記1～4分?？傇u分0～22分，總分越高說明肝臟病理改變越嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布的多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較進(jìn)行Student-Newman-Keuls配對t檢驗(yàn)。各檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的鑒定 大鼠ADSCs高表達(dá)CD29、CD49d、CD90表面抗原，低表達(dá)CD34、CD45表面抗原，符合MSCs表面抗原表達(dá)特征（圖1）。

圖1 ADSCs的表面抗原檢測Fig.1 Surface antigen detection of ADSCs

2.2 IL-1β體外誘導(dǎo)ADSCs分化 未加入生長因子誘導(dǎo)的ADSCs形態(tài)呈長梭形，而加入肝細(xì)胞生長因子與IL-1β誘導(dǎo)因子的ADSCs形態(tài)發(fā)生明顯變化，誘導(dǎo)第7天時(shí)細(xì)胞由成纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變化上皮樣細(xì)胞形態(tài)，至誘導(dǎo)第21天時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞以類圓形為主，呈現(xiàn)肝樣細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

圖2 ADSCs向肝樣細(xì)胞的分化（×100）Fig.2 Differentiation of ADSCs into hepatocyte like cells（×100）

未加入肝細(xì)胞生長因子與IL-1β誘導(dǎo)因子的ADSCs未見白蛋白與CK18蛋白表達(dá)。加入肝細(xì)胞生長因子與IL-1β誘導(dǎo)因子的ADSCs白蛋白與CK18蛋白均呈陽性表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，各組白蛋白與CK18蛋白陽性表達(dá)增加，同時(shí)隨著誘導(dǎo)因子IL-1β濃度的增加，相同時(shí)間下的白蛋白與CK18蛋白陽性表達(dá)增加（表1）。

表1 各組ADSCs中白蛋白與CK18蛋白陽性表達(dá)（±s，n=5，%）Tab.1 Positive expression of albumin and CK18 protein in ADSCs of each group（±s，n=5，%）

表1 各組ADSCs中白蛋白與CK18蛋白陽性表達(dá)（±s，n=5，%）Tab.1 Positive expression of albumin and CK18 protein in ADSCs of each group（±s，n=5，%）

Note：Compared with HGF group，1）P＜0.01；compared with HGF+5IL-1β group，2）P＜0.01；compared with HGF+10IL-1β group，3）P＜0.01.

Groups HGF HGF+5IL-1β HGF+10IL-1β HGF+20IL-1β 24 h 15.30±1.21 30.29±4.231）46.38±3.791）2）78.38±5.251）2）3）Albumin 48 h 42.16±3.41 59.88±2.661）74.32±3.111）2）84.04±4.771）2）3）72 h 69.09±5.42 77.88±2.641）84.38±3.191）2）94.36±2.111）2）3）24 h 8.96±2.17 24.33±3.241）39.86±4.771）2）59.26±5.941）2）3）CK18 protein 48 h 20.37±4.36 40.81±6.351）68.99±5.821）2）79.38±4.511）2）3）72 h 48.68±6.78 71.09±3.271）82.09±4.991）2）92.45±6.191）2）3）

2.3 ADSCs的慢病毒轉(zhuǎn)染 熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染重組慢病毒IL-1β-Lv-GV358與Lv-GV358的ADSCs可見大量綠色熒光表達(dá)，細(xì)胞熒光陽性率為98%（圖3A、B）；Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染重組慢病毒IL-1β-Lv-GV358 ADSCs的IL-1β蛋白表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染重組慢病毒的ADSCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C、D）。

圖3 ADSCs的慢病毒轉(zhuǎn)染Fig.3 Lentivirus transfection of ADSCs

2.4 肝功能的檢測 移植后24 h、48 h、72 h模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值持續(xù)升高，同組不同時(shí)間點(diǎn)間各指標(biāo)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植后24 h和48 h，未轉(zhuǎn)染組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值持續(xù)升高，同組不同時(shí)間點(diǎn)間各指標(biāo)值比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；移植后72 h，未轉(zhuǎn)染組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值降低。移植后24 h、48 h、72 h，轉(zhuǎn)染組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值持續(xù)降低，同組不同時(shí)間點(diǎn)間各指標(biāo)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植后48 h和72 h，未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值低于模型組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值低于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），見表2。

表2 各組肝功能的比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of liver function of each group（±s，n=6）

表2 各組肝功能的比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of liver function of each group（±s，n=6）

Note：In the same group，compared with 24 h after transplantation，1）P＜0.05；in the same group，compared with 48 h after transplantation，2）P＜0.05；at the same time point，compared with model group，3）P＜0.05；at the same time point，compared with non transfection group，4）P＜0.05.

Transplant time 24 h 48 h 72 h Transplant time 24 h 48 h 72 h Transplant time 24 h 48 h 72 h Model 276.25±16.40 428.55±29.611）546.88±38.171）2）Model 298.15±39.51 412.37±54.221）567.34±61.201）2）Non transfected 256.37±17.36 389.36±12.551）3）302.66±10.771）2）3）Aspartate aminotransferase（U/L）Non transfected 271.85±29.63 379.11±19.881）3）302.53±15.621）2）3）Total bilirubin（μmol/L）Transfected 246.23±9.16 188.18±6.771）3）4）108.14±5.481）2）3）4）Transfected 265.39±20.97 199.64±23.591）3）4）99.85±18.641）2）3）d Model 37.29±2.79 89.66±5.411）128.57±5.661）2）Alanine aminotransferase（U/L）Non transfected 36.28±2.21 44.26±3.551）3）31.41±2.341）2）3）Transfected 33.18±3.45 25.72±3.871）3）4）17.22±3.111）2）3）4）

2.5 肝臟病理 移植后24 h，模型組肝細(xì)胞水腫，可見點(diǎn)狀變性壞死與炎性滲出，提示急性肝衰竭造模成功；此后肝臟壞死程度逐漸加重，至移植后72 h時(shí)肝細(xì)胞呈大片狀壞死，結(jié)構(gòu)明顯破壞，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。移植后24 h，兩細(xì)胞移植治療組也可見肝細(xì)胞水腫、點(diǎn)狀變性壞死與炎性滲出，至移植后48 h時(shí)，該兩組肝臟病理改變較模型組明顯改善；移植后72 h時(shí)，兩細(xì)胞移植治療組肝臟病理進(jìn)一步改善，且轉(zhuǎn)染組改善情況好于未轉(zhuǎn)染組，僅見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及小量炎癥細(xì)胞浸潤（圖4）。

圖4 各組移植后72 h肝臟組織病理（HE，×200）Fig.4 Liver histopathology 72 h after transplantation in each group（HE，×200）

根據(jù)HAI評分系統(tǒng)對肝臟組織炎癥壞死程度計(jì)分，移植后24 h時(shí)3組評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組移植后48 h、72 h的評分低于模型組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組移植后48 h、72 h的評分低于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），具體結(jié)果見表3。

表3 各組肝臟組織病理評分（±s，n=6）Tab.3 Pathological score of liver in each group（±s，n=6）

表3 各組肝臟組織病理評分（±s，n=6）Tab.3 Pathological score of liver in each group（±s，n=6）

Note：In the same group，compared with 24 h after transplantation，1）P＜0.05；in the same group，compared with 48 h after transplantation，2）P＜0.05；at the same time point，compared with model group，3）P＜0.05；at the same time point，compared with non transfection group，4）P＜0.05.

Groups Model Non transfected Transfected 24 h after transplantation 4.7±0.8 4.5±0.6 4.4±0.5 48 h after transplantation 14.3±1.51）10.6±0.91）3）8.3±0.71）3）4）72 h after transplantation 16.3±0.81）2）8.9±0.41）2）3）4.9±0.22）3）4）

2.6 ADSCs在肝內(nèi)的存活 肝臟病理切片如圖5所示，顯示，移植的脂肪間充質(zhì)分布在肝組織中央靜脈周圍與肝竇中，同時(shí)也可見轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度高于未轉(zhuǎn)染組。

圖5 大鼠肝組織內(nèi)移植的ADSCs（熒光顯微鏡，×100）Fig.5 Transplanted ADSCs in rat liver tissue（fluorescence microscope，×100）

3 討論

急性肝衰竭常用的治療方法為保肝、降酶、退黃疸及相應(yīng)的對癥治療，臨床療效不甚理想，而肝移植治療又存在供體缺乏、費(fèi)用昂貴等問題，因此尋找新的方式治療肝衰竭至關(guān)重要。移植MSCs、肝祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞等是治療肝臟疾病很有前途的方法。ADSCs來源廣泛，取材容易，增殖能力與擴(kuò)增能力強(qiáng)，免疫排斥反應(yīng)小，且不存在倫理問題，具有較廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前有關(guān)ADSCs移植治療肝衰竭的研究較多，但多集中于細(xì)胞體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方面［9］，體內(nèi)移植研究相對較少。

目前ADSCs移植治療肝衰竭的機(jī)制尚未完全明確，主要有以下幾種途徑［10］：①抑制肝細(xì)胞凋亡：急性肝衰竭后肝細(xì)胞大量凋亡，ADSC可通過分泌抗凋亡因子來抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮治療作用；②抑制肝纖維化：急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞凋亡伴隨而來的是肝內(nèi)星狀細(xì)胞大量增生，肝纖維化形成，ADSC移植可通過分泌增加血管內(nèi)皮生長因子與肝細(xì)胞生長因子分泌來抑制肝纖維化；③抑制炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)：急性肝衰竭后免疫因子活化，分泌大量炎癥介質(zhì)，而MSCs移植可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞增殖與血管內(nèi)皮生長因子分泌，抑制炎癥反應(yīng)；④分化為肝樣細(xì)胞：移植的ADSCs可被誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞，參與肝臟組織修復(fù)。

目前已有基因工程技術(shù)研究在移植前對ADSCs進(jìn)行靶基因轉(zhuǎn)染，以進(jìn)一步提高ADSCs的存活率與目的基因的表達(dá)，成為新的治療熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素是在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，其中的IL-1具有免疫調(diào)節(jié)作用，可與活化APC及T細(xì)胞協(xié)同促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分泌大量抗體，誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成。同時(shí)IL-1β為參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，可激活T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其表達(dá)黏附分子，從而誘發(fā)炎癥細(xì)胞的募集與浸潤，導(dǎo)致組織損傷，尤其是肝臟組織［11］。因此，降低炎癥反應(yīng)在急性肝衰竭治療中具有重要所用。如MA等［12］通過尾靜脈注射IL-1β siRNA腺病毒液與骨髓MSCs來治療小鼠急性肝衰竭，結(jié)果顯示IL-1β siRNA腺病毒可有效降低急性肝衰竭小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并可通過提高移植骨髓MSCs的存活增殖其組織修復(fù)能力與再生能力，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同肝臟保護(hù)作用。但與MA等［12］研究不同的是，本實(shí)驗(yàn)將IL-1β直接轉(zhuǎn)染至ADSCs中移植治療急性肝衰竭，得到了可促進(jìn)急性肝衰竭大鼠肝功能的恢復(fù)、降低肝組織病理評分、加快肝臟組織的修復(fù)的結(jié)論，筆者認(rèn)為，雖然IL-1β是損傷肝組織釋放的重要炎癥因子，但其又是MSCs發(fā)揮免疫抑制功能的生長因子，并可增強(qiáng)MSCs向受損組織的遷移、定植與黏附能力，增加各種生長因子的表達(dá)及分泌。已有研究顯示將MSCs與肝細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，MSCs可通過分泌IL-1、IL-6與IL-10等促進(jìn)肝細(xì)胞的生長，延長肝細(xì)胞生存時(shí)間［13］。還有研究證實(shí)促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α等可增加肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)［14］。IL-1β為IL-1的主要存在形式，存在于血液中，具有與TNF-α相似的生理與代謝作用，并能夠與TNF-α協(xié)同發(fā)揮作用。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，IL-1β聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)ADSCs轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞白蛋白與CK18蛋白表達(dá)陽性，提示白細(xì)胞介素聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)ADSCs分化為肝樣細(xì)胞，并且這種誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出時(shí)間與劑量依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將IL-1β以慢病毒感染的方式轉(zhuǎn)染至ADSCs，觀察其治療急性肝衰竭的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對于模型組，移植ADSCs可改善急性肝衰竭模型大鼠的肝功能，降低肝臟病理評分，加快損傷肝臟的修復(fù)，證實(shí)了尾靜脈移植的ADSCs可歸巢至肝臟組織內(nèi)發(fā)揮修復(fù)作用。而兩細(xì)胞移植組間也具有明顯差異：與單純的ADSCs移植相比，IL-1β基因修飾的ADSCs移植治療可進(jìn)一步改善急性肝衰竭模型大鼠的肝功能，降低肝臟病理評分，加快損傷肝臟的修復(fù)。

因此，課題組推測IL-1β可能通過促進(jìn)ADSCs的增殖、遷移與分化來增強(qiáng)其治療急性肝衰竭的效果。但本研究未進(jìn)行體內(nèi)肝向分化檢測，其結(jié)果有待進(jìn)一步探討。