葫蘆巴堿的預防性使用可減輕妊高癥大鼠模型的癥狀并保護胎兒生長和血管內(nèi)皮功能

史許鋒,劉 侃,王 莉,王煥萍,張敬麗,武海英

(河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科,鄭州 450003)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種嚴重的母體炎癥性疾病,具有內(nèi)皮細胞功能障礙,尚缺乏有效的治療和預防方法。子癇前期是一種妊娠特異性綜合征,全球發(fā)病率在2%~8%之間,是導致早產(chǎn)、孕產(chǎn)婦死亡的主要原因[1-2]。PE定義為妊娠20周或之后伴有新發(fā)蛋白尿,子宮胎盤功能障礙或其他母體器官功能障礙的妊娠高血壓[3]。除終止妊娠外,尚無有效的PE治療方法,對PE高風險孕婦的預防措施也很有限[4]。此外,有PE病史的女性患心血管疾病的風險更高[5]。因此,預防PE對預防女性心血管疾病具有重要意義。

PE的發(fā)病機制仍不清楚,有證據(jù)表明它與局部和全身性血管內(nèi)皮損傷以及炎癥的過度活化有關(guān)[6]。PE患者胎盤中抗血管生成分子和炎性因子分泌明顯增加,從而導致內(nèi)皮表面分子模式的急劇變化,并導致全身性內(nèi)皮功能障礙、血管收縮和隨后的高血壓[7]。因此,調(diào)節(jié)抗血管生成因子的平衡,減少過度的炎癥激活以及保護內(nèi)皮功能是治療和預防PE的關(guān)鍵目標。葫蘆巴堿(trigonelline)為傳統(tǒng)中藥益母草的有效成分,具有抗氧化、保護心腎、提高生育等作用,以往研究指出,葫蘆巴堿的使用可以通過JAK/Stat3等信號通路而抑制炎癥機制的過度激活,促進血管新生,并通過NO-cGMP途徑起血管舒張作用,最終發(fā)揮血管保護作用[8]。此外,在異氟醚麻醉的小鼠模型中,葫蘆巴堿的預防性使用可以抑制異氟醚麻醉誘導的心肌凋亡[9]。然而,預防性使用葫蘆巴堿對于PE癥狀的治療作用尚未見報道,因此,本研究旨在確定妊娠早期使用葫蘆巴堿對于一氧化氮合酶拮抗劑N-硝基-1-精氨酸甲酯(LNAME)誘導的PE大鼠的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠28只,8~10周齡,體重200~220 g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006),將大鼠飼養(yǎng)于鄭州大學動物實驗中心[SYXK(豫)2019-00013]。溫度控制在(23±3)℃,濕度(50±10)%和光照-黑暗周期(12 h∶12 h)的條件下,自由進食和飲水。本實驗的研究過程遵循實驗動物3R原則。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準((2019)倫審第(38)號)。

1.2 主要試劑與儀器

LNAME(江藍純生物試劑有限公司,中國);葫蘆巴堿(安諾倫生物科技有限公司,中國);CMC(安諾倫生物科技有限公司,中國);高碘酸席夫(Schiff,美國);PrimeScript RT試劑盒(成都靈動生物技術(shù)有限公司,中國);TB Green Premix Ex Taq II(Takara Biotechnology,日本);總蛋白提取試劑(維潤賽潤生物試劑有限公司,中國);聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國);HPR偶聯(lián)的二抗(博拓生物科技股份有限公司,中國);sFlt-1酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、PlGF ELISA試劑盒,NO ELISA試劑盒,eNOS ELISA試劑盒,TNF-αELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒(試劑盒均購置于利翰生物科技有限公司,中國);光學顯微鏡(Leica Microsystems,德國);MS550D換能器和Visual Sonic超聲系統(tǒng)(Visual Sonic,美國);ABI Prism 7300系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 治療方法

將雌性大鼠與雄性大鼠(2∶1)交配,并且檢測到陰栓時記為妊娠日GD 0,然后將雌性大鼠從GD 0隨機分為四組,每組7只。對照組:GD 9-20時通過經(jīng)口管飼法給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC);LNAME組:GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME[10];低劑量葫蘆巴堿組(LT組,n=7):GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以2 mg/(kg·d)的劑量經(jīng)口管飼法給予葫蘆巴堿-20溶于CMC;(4)高劑量葫蘆巴堿組(HT組):GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以10 mg/(kg·d)的劑量經(jīng)口管飼法給予葫蘆巴堿-20(溶于CMC)。

LNAME是一種一氧化氮合成酶抑制劑,孕鼠注射LNAME可產(chǎn)生與人類PE類似的表型,主要表現(xiàn)在高血壓和蛋白尿,通過上述可以判斷PE模型的情況。

1.3.2 血壓測量

使用無創(chuàng)自動血壓分析儀(第一三共株式會社,日本)通過尾袖法[11]在有意識大鼠中測量收縮壓(SBP),舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP)。

1.3.3 蛋白尿監(jiān)測

在GD 0和GD 18時采用代謝籠收集24 h的尿液,將樣品儲存在-80℃并進行分析以評估蛋白質(zhì)濃度(Thermo Scientific,美國)。

1.3.4 高頻超聲成像

在GD 19時使用高頻超聲成像檢測母體血流介導的股動脈擴張(FDM)和股動脈壁切應力(WSS),使用MS550 D換能器和Visual Sonic超聲系統(tǒng)獲得圖像,測量值(靜態(tài)圖像和視頻剪輯/電影循環(huán))以數(shù)字方式存儲,用于脫機分析血流介導的擴張[12]。

1.3.5 組織取樣

在GD 20時脫頸處死檢查子宮的胎盤和胎兒的重量和長度,同時切除母鼠腎,將胎盤和腎轉(zhuǎn)移到液氮中,并保存在-80℃進行Western blot印跡或聚合酶鏈反應(PCR)分析,或保存在4%多聚甲醛中進行組織學檢查。

1.3.6 組織學和免疫組化

將胎盤組織樣品在4%多聚甲醛中固定48 h,包埋在石蠟中,切成5μm厚的切片,并用蘇木精和曙紅染色;將腎組織切成3μm厚的切片,用高碘酸席夫染色后評估腎小球硬化指數(shù)[13]。

對于免疫組織化學,將切片與抗大鼠抗p-NFκB p65(Abcam,英國,1∶500)抗體一起孵育,使用光學顯微鏡進行顯微鏡分析,通過Image J對結(jié)果進行定量分析。

1.3.7 sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6激活測定

在GD 20時從主動脈收集血液到抗凝管中,以2000 r/min離心15 min分離血漿,根據(jù)制造商的說明,使用sFlt-1酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、PlGF ELISA試劑盒、NO ELISA試劑盒、eNOS ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒測量sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6的血漿濃度。

1.3.8 實時定量PCR

按照制造商的說明使用TRIzol提取組織總RNA,通過Agilent 2100生物分析儀檢測RNA的完整性,使用PrimeScript RT試劑盒從等量的不同樣品RNA中合成cDNA,并使用TB Green Premix Ex Taq II用于進行PCR反應,以GAPDH用作內(nèi)部對照,通過ABI Prism 7300系統(tǒng)測量TNF-α、IL-6、NF-κB p65和GAPDH的表達。引物組的序列列于表1。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.9 蛋白質(zhì)印跡分析

按照制造商的說明使用總蛋白提取試劑提取組織總蛋白,在100℃下加熱5 min,將蛋白質(zhì)裂解物(35 mg)在Tris-甘氨酸緩沖的10%SDS-PAGE上通過電泳分級分離,并將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜在室溫下封閉2 h,然后與p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65和NF-κB p65的相應一抗孵育過夜,隨后將膜與HPR偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h,將蛋白質(zhì)表達標準化為GAPDH的表達,使用增強化學發(fā)光法(ECL,Keygen)檢測蛋白信號,并使用Image J 2x軟件分析條帶。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0(美國SPSS Inc.)進行,結(jié)果表示為平均數(shù)±標準差(±s)。如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且具有均一的方差,則使用t方差單向分析后通過最低顯著性差異(LSD)進行t檢驗,以計算各個研究組之間的差異;方差不一致時,則使用Dunnett T3分析組之間的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 葫蘆巴堿可預防PE大鼠的妊娠高血壓,蛋白尿,低母體體重和胎鼠生長受限

妊娠初期四組血壓無明顯差異,在GD10時,LT和HT組的血壓顯著低于LNAME組的血壓,且LT和HT組的血壓在整個懷孕期間仍與對照組相似(P＞0.05,圖1A、1B、1C);此外,GD 0時四組蛋白尿之間無顯著差異(P＞0.05),而在GD18上,LT和HT組的蛋白尿明顯低于LNAME組(P＜0.001),LNAME組的蛋白尿明顯高于對照組(P＜0.001),LT,HT和對照組之間則無顯著差異(P＞0.05,圖1D)。Control組胎兒數(shù)量(11.5±1.7)與L-NAME組(12.4±0.8)、LT組(11.8±2.1)、HT組(12.6±1.6)之間無顯著差異(P＞0.05)。LNAME組的體重降低,胎兒身長(P＜0.001)和體重(P＜0.01)顯著低于其他組,而LT和HT組母體體重和胎鼠生長被明顯保護(圖1E、1H、1I),四組胎盤直徑或重量無顯著差異(P＞0.05,圖1F)

圖1 葫蘆巴堿對子癇前期癥狀的影響(ˉx±s)Note.A~C,Blood pressure in four groups of pregnant rats.D,Proteinuria.E,Weight gain in pregnant rats.F,Placental length.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,###P＜0.001.Figure 1 Effect of Trigonelline on preeclampsia

2.2 葫蘆巴堿可以緩解PE樣大鼠的胎盤和腎組織學損傷

對照組的胎盤迷路區(qū)規(guī)則且血液豐富,而LNAME組大鼠胎盤迷路區(qū)混亂并存在合胞性結(jié)節(jié),這些結(jié)節(jié)可能阻礙胎盤的血液供應并降低胎盤的功能,在預防性使用葫蘆巴堿后,大鼠胎盤迷路區(qū)顯示出明顯的改善,結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少(圖2A,P＜0.001),此外,LNAME組的腎小球硬化指數(shù)顯著高于對照組,與LNAME組相比,LT和HT組的腎小球硬化指數(shù)被明顯改善(P＜0.01,圖2B、2C)。

圖2 葫蘆巴堿減輕LNAME誘發(fā)的先兆子癇樣大鼠的胎盤和腎的形態(tài)損傷(ˉx±s)Note.A,HE staining images of placenta(n=4,Keywords syncytial nodules marked with arrows).B,PAS staining images of the kidneys(Glomerular sclerosis marked with arrows,n=3).C,Glomerular sclerosis index(n=3).Compared with control group,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 2 Trigonelline attenuates LNAME induced morphological damage to the placenta and kidneys in preeclampsia rats

2.3 葫蘆巴堿可改善PE大鼠血漿中的內(nèi)皮依賴性血管舒張,內(nèi)皮功能生物標志物和平衡的血管生成分子

四組大鼠基線股動脈直徑差異無統(tǒng)計學意義(圖3A、3B,P＞0.05),缺血5 min后,對照組,LT組和HT組的FMD隨時間逐漸增加,在120 s達到峰值,LNAME組在240 s達到峰值,LNAME組的FMD峰值顯著低于對照組,LT和HT組(圖3C);此外,四組之間基線WSS沒有顯著差異,缺血后四組WSS隨時間變化,與LNAME組相比,葫蘆巴堿使LT和HT組的WSS明顯降低(圖3D)。

圖3 葫蘆巴堿對內(nèi)皮功能和血管生成因子的影響(ˉx±s)Note.A,Femoral artery diameter in four groups of rats.B,Pulse Doppler images.C,Blood flow-mediated dilation.D,Wall shear stress.E,NO in plasma.F,eNOS.G,sFlt-1.H,PlGF.I,sFlt-1/PlGF ratios.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.001,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 3 Effects of Trigonelline on endothelial function and angiogenic factors

與LNAME組相比,LT和HT組的血漿NO恢復到正常水平,與對照組相似(圖3E,P＞0.05),血漿eNOS水平得到改善(圖3F,P＜0.001),與LNAME組相比,LT和HT組的血漿sFlt-1水平顯著降低(圖3G),HT組的血漿PlGF值恢復至與對照組相似的水平(圖3H,P＞0.05),同時,LT和HT組的sFlt-1/PlGF比率明顯低于LNAME組的比率(圖3I,P＜0.001)。

2.4 葫蘆巴堿可以抑制PE樣大鼠血漿和組織中炎性細胞因子的釋放

LNAME誘導的大鼠的血漿TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(P＜0.01),而LT和HT組的血漿水平顯著降低(P＜0.01,圖4A、4B),與對照組相比,LNAME組血漿與腎中TNF-α和IL-6的mRNA水平顯著增加(P＜0.001),而LT和HT組TNF-α和IL-6的mRNA水平明顯降低,且HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖4C、4D、4E、4F)。

圖4 葫蘆巴堿的預防性給藥可以下調(diào)血漿,胎盤和腎中的炎性細胞因子(ˉx±s)Note.A/B,Levels of TNF-αand IL-6 in plasma of four groups of rats.C/D,Expression of TNF-αand IL-6 mRNA in rat placenta of four groups.E/F,TNF-αand IL-6 mRNA expression in the kidney of four groups of rats.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 4 Prophylactic administration of Trigonelline can downregulate inflammatory cytokines in plasma,placenta and kidney

2.5 葫蘆巴堿可抑制PE大鼠胎盤中的炎癥

免疫組織化學分析顯示,LT和HT組的胎盤中p-NF-κB水平明顯低于LNAME組(P＜0.001),NFκB的mRNA表達明顯降低(P＜0.001),而HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖5A、5B、5C),此外,與LNAME組相比,葫蘆巴堿組中p-IκBα與IκBα的比率以及NF-κB與p-NF-κB的比率顯著降低(圖5D、5E、5F、5G,P＜0.001),這些數(shù)據(jù)表明葫蘆巴堿抑制LNAME誘導的PE樣大鼠胎盤中的炎癥可能與IκBα/NFκB信號通路有關(guān)。

圖5 葫蘆巴堿抑制PE大鼠胎盤中的IκBα/NF-κB信號通路(ˉx±s)Note.A,Immunohistochemical staining of placental tissue p-NF-κB in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the placenta.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-NF-κB to IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to IκBα.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 5 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat placenta by Trigonelline

2.6 葫蘆巴堿可以抑制PE大鼠腎的炎癥

免疫組織化學分析顯示,LT和HT組的腎中p-NF-κB與NF-κB的mRNA水平明顯低于LNAME組(P＜0.01),而HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖6A、6B、6C),此外,與LNAME組相比,葫蘆巴堿組中p-IκBα與IκBα的比率以及NF-κB與p-NF-κB的比率顯著降低(圖6D、6E、6F、6G,P＜0.01)。這些數(shù)據(jù)表明葫蘆巴堿抑制LNAME誘導的PE樣大鼠腎的炎癥可能與IκBα/NF-κB信號通路有關(guān)。

圖6 葫蘆巴堿抑制PE大鼠腎中的IκBα/NF-κB信號通路(±s)Note.A,Immunohistochemical staining p-NF-κB renal tissue in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the kidneys.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-IκBαto IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to NF-κB.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared to the LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 6 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat kidney by Trigonelline

3 討論

由于妊娠期間宮內(nèi)暴露于高血壓,妊娠高血壓的母親及其后代都有長期的心血管后遺癥,因此,患有PE高危因素的孕婦的患者應進行預防性干預[14-15]。但是,預防PE的措施是有限的,而阿司匹林是唯一具有可靠預防PE的藥物[16]。研究表明[17],PE與炎癥反應和內(nèi)皮功能障礙有關(guān),葫蘆巴堿可以通過抑制炎癥舒張血管平滑肌而發(fā)揮內(nèi)皮功能保護作用。因此,在這項研究中,我們使用葫蘆巴堿進行PE的預防性治療。

葫蘆巴堿的預防性給藥可預防LNAME誘導的PE樣妊娠大鼠的高血壓,同時降低孕鼠尿蛋白,將胎盤的長度和重量恢復至正常水平,此外,由于葫蘆巴堿可以緩解胎兒生長限制,孕期孕鼠的體重增加相應增加,此外,在妊娠早期服用葫蘆巴堿時,血壓不低于正常水平,這表明葫蘆巴堿不會因降低血壓而降低母體灌注。最后,胎盤和腎的組織學檢查表明葫蘆巴堿起保護作用,而蛋白印跡和PCR分析提示葫蘆巴堿的保護作用與IκBα/NF-κB途徑抑制相關(guān)。

葫蘆巴堿的預防性給藥可預防LNAME誘導的PE樣妊娠大鼠模型中血流介導的FMD峰值明顯較低,而FMD是一種通過測量短暫性腦缺血后動脈直徑的變化來評估內(nèi)皮功能的技術(shù),與使用內(nèi)皮素,一氧化氮和其他生物標記物相比,FMD具有無創(chuàng),可靠且具有系列特征的特點,被廣泛用于評估內(nèi)皮功能,或者懷孕期間的心血管風險[18]。葫蘆巴堿改善可以內(nèi)皮舒張功能從而表現(xiàn)為FMD峰值的增加,同時降低血管壁的切應力,并恢復NO和eNOS的血漿水平,改善由LNAME誘導的PE樣大鼠的內(nèi)皮功能障礙。PE的病理機制與異常循環(huán)血管生成因子有關(guān),可溶性酪氨酸激酶-1(sFlt-1)與循環(huán)的PlGF和VEGF結(jié)合,從而降低其在子宮胎盤和母體循環(huán)中的水平,導致內(nèi)皮功能障礙,血管收縮和高血壓[19-20]。本研究的結(jié)果顯示,葫蘆巴堿改善孕鼠sFlt-1和PlGF的平衡,并降低了sFlt-1/PlGF,表明葫蘆巴堿可以保護LNAME誘導的PE樣大鼠的內(nèi)皮功能。與健康對照組孕婦和非孕婦相比,PE婦女的TNF-α和IL-6水平顯著升高,并導致內(nèi)皮功能障礙[20]。近期文獻報道[21],甲醛吸入可引起小鼠肺和全身損傷,而葫蘆巴堿的給藥可降低血漿中的TNF-α,IL-6和KC/GRO水平,并降低胎盤中TNF-α的表達。我們的數(shù)據(jù)表明,葫蘆巴堿的預防性給藥可降低血漿中TNF-α和IL-6的水平,同時抑制LNAME誘導的PE樣大鼠模型的胎盤和腎臟中TNF-α和IL-6的表達,這表明葫蘆巴堿可降低LNAME誘導的PE模型中的炎性細胞因子。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥的重要因素,它在炎癥反應的激活中起著關(guān)鍵作用,而炎癥反應涉及許多重要的人類疾病[22],例如心血管疾病和PE,此外,研究表明[23],NF-κB信號的激活加劇妊娠孕婦的內(nèi)皮功能障礙。本研究的結(jié)果指出,葫蘆巴堿對胎盤和腎的保護作用可能與IκBα/NF-κB信號通路有關(guān),通過抑制其表達和激活而降低胎盤和腎的炎癥狀態(tài)。

總之,本研究的結(jié)果表明,葫蘆巴堿在LNAME誘導的PE樣大鼠模型中的預防性使用可減輕PE癥狀,促進胎兒生長,保護內(nèi)皮功能并抑制IκBα/NF-κB途徑以減少炎癥反應。