四川某豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病感染情況檢測(cè)分析

胡 曉，楊 蕊

（1.內(nèi)江市種豬場(chǎng)，四川 內(nèi)江 641007；2.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又名豬藍(lán)耳病，是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型高致病性傳染病。該病在1987年最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)。2007年1月我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病［1］。豬藍(lán)耳病在各個(gè)豬場(chǎng)之間廣泛傳播，有的豬場(chǎng)使用疫苗，而有的未使用，但均有一些豬場(chǎng)發(fā)病，主要引起繁殖母豬生產(chǎn)性能嚴(yán)重下降和仔豬的呼吸道癥狀，生長(zhǎng)發(fā)育不良，甚至繼發(fā)細(xì)菌性傳染病，如副豬、傳胸等，給豬場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)以四川某豬場(chǎng)未進(jìn)行藍(lán)耳病疫苗免疫的3～4月齡架子豬為研究對(duì)象，采集血液樣本235 份分離血清，用間接ELISA 法檢測(cè)豬藍(lán)耳病抗體，同時(shí)根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒ORF6 基因設(shè)計(jì)引物，采集19 份血液樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)?，F(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下：

1 試驗(yàn)材料

1.1 被檢血清及血液樣本的采集 血清樣本采集：隨機(jī)選擇四川某豬場(chǎng)未進(jìn)行藍(lán)耳病疫苗免疫的3～4月齡架子豬，前腔靜脈采血2～5 mL，共采集235 份，放入離心管中，室溫下靜置2～4 h，待血液凝固血清析出后，以3 000 r/min 離心分離血清，于-20 ℃保存待檢。

血液樣本采集：使用醫(yī)用真空抗凝采血管，隨機(jī)采集未免疫的架子豬前腔靜脈血液2～5 mL，共采集19份，置4～8 ℃保存待檢。

1.2 試劑 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒，山東綠都生物科技有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：2018010136）；RNA基因組提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：20170503202）。

2 方法

2.1 豬血清藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)

2.1.1 樣品準(zhǔn)備 將保存的待測(cè)血清取出，室溫靜置30 min，用試劑盒樣品稀釋液對(duì)血清樣品進(jìn)行40倍稀釋，陰、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行4倍稀釋。

2.1.2 試劑準(zhǔn)備 將10×濃縮洗滌液在使用前恢復(fù)至室溫，有沉淀的等到其沉淀溶解，然后用蒸餾水進(jìn)行10 倍稀釋（即10 μL 濃縮洗滌液加入90 μL的蒸餾水）。

2.1.3 操作步驟 將試劑盒取出，待其恢復(fù)至室溫。取出抗原包被板，根據(jù)樣品數(shù)拆分出需要的孔數(shù)，并對(duì)樣品位置進(jìn)行標(biāo)記和記錄，在相應(yīng)孔的位置上加入稀釋好的樣品100 μL。各取100 μL 陰、陽(yáng)性對(duì)照加入到抗原包被板中，每次檢測(cè)各設(shè)兩孔對(duì)照。加樣完成后，37℃孵育30min。將各孔的廢液棄去，每孔加入稀釋好的洗滌液200 μL洗板，重復(fù)此操作5次，每次2～3 min。倒掉洗滌液后將孔中殘留的液體拍干，每孔加入酶標(biāo)二抗100 μL，37 ℃孵育30 min。再將孔中液體棄去，加入洗滌液洗板，重復(fù)5 次，拍干，每孔加入100 μL TMB 底物液。37 ℃孵育15 min 后，用移液槍在板條上每孔加50 μL 的終止液，立刻于450 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值。

2.1.4 結(jié)果判斷（按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的陰陽(yáng)性需通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品的S/P值來(lái)判斷。

計(jì)算方法：樣本S/P 值＝（樣本OD 值－陰性值的平均值）/（陽(yáng)性值的平均值－陰性值的平均值）。

若樣品S/P 值≥0.25，則判定為抗體陽(yáng)性；若樣品S/P值≤0.20，則判定為抗體陰性；若0.20≤樣品S/P值≤0.25，則判定為可疑。

2.2 藍(lán)耳病RT-PCR檢測(cè)

2.2.1 藍(lán)耳病病毒ORF6 基因引物合成 根據(jù)已知的ORF6 基因引物序列，送上海生工生物公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 ORF6基因引物

2.2.2 豬藍(lán)耳病病毒RNA 的提取 將保存的待測(cè)液取出加入100～200 μL 氯仿，用力搖勻。將加好氯仿的血液樣品以12 000 r/min 冷凍離心15 min，吸取上清液移入到新的去RNA 酶離心管中，加入0.25 mL異丙醇，輕柔地翻轉(zhuǎn)幾次將其搖勻，在冰盒上靜置35 min后以12 000 r/min冷凍離心15 min，棄去上清液取400 μL 用75%的酒精進(jìn)行三次洗滌，盡量去除離心管內(nèi)的異丙醇等其他物質(zhì)。用移液槍把離心管內(nèi)剩余的液體盡量吸干凈，打開(kāi)離心管蓋放冰盒上10 min 待酒精揮發(fā)晾干，根據(jù)沉淀的多少加入20～40 μL 的去RNA 酶水，懸浮靜置片刻待其溶解后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 豬藍(lán)耳病病毒RNA 的反轉(zhuǎn)錄 將上一步獲得的RNA作為模板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室制定的反轉(zhuǎn)錄條件配制反轉(zhuǎn)錄體系。在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)30 ℃退火反應(yīng)，42 ℃延伸反應(yīng)，99 ℃變性反應(yīng)后獲得豬藍(lán)耳病病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系見(jiàn)表2，反轉(zhuǎn)錄條件見(jiàn)表3。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

表3 反轉(zhuǎn)錄條件

2.2.4 ORF6基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 將以上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用上、下游引物擴(kuò)增目的基因片段，再添加Taq DNA酶、dNTP于PCR反應(yīng)管中，用ddH2O 配平反應(yīng)體系。然后將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中，發(fā)生預(yù)變性、變性、退火、延伸、總延伸反應(yīng)，同時(shí)經(jīng)過(guò)30 個(gè)循環(huán)后，得到PCR產(chǎn)物。反應(yīng)體系及條件見(jiàn)表4。

表4 PCR反應(yīng)體系及條件

2.2.5 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 取0.4 g 瓊脂糖加入40 mL 水配制成濃度為1%的凝膠，在微波爐上熔至清澈透明的溶液狀。冷卻到60 ℃左右，加入EB 染料，搖勻，倒入事先安裝好的水平電泳槽內(nèi)，凝膠厚度一般為3～5 mm，等到凝膠完全凝固后，室溫下放置30 min。根據(jù)樣品量選用梳子，在梳子齒附近加入少量電泳緩沖液，后緩慢輕輕地向上拔掉梳子，將凝膠放入電泳槽中，用移液器吸取樣品注入孔內(nèi)。給電泳儀通上電，30 min 后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 豬血清藍(lán)耳病ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)未免疫的235 份血清樣品進(jìn)行ELISA 抗體檢測(cè)，結(jié)果得出陽(yáng)性149份，陰性52份，可疑34份，陽(yáng)性率為63.4%。

3.2 豬藍(lán)耳病RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用RTPCR方法對(duì)19份血液樣本進(jìn)行藍(lán)耳病病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示：19 份樣本中只有367-8 號(hào)樣本為陽(yáng)性，其余18份樣本均為陰性，陽(yáng)性率為5.26%（見(jiàn)表5）。

表5 豬藍(lán)耳病RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

4.1 Albina 等［2］用PRRSV 接種豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）培養(yǎng)病毒抗原，首次建立了檢測(cè)PRRSV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，其特異性和敏感性高于過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）和間接免疫熒光法（IFA）。本試驗(yàn)也采用ELISA 方法對(duì)未免疫架子豬的血清進(jìn)行（PRRSV）抗體檢測(cè)。結(jié)果陽(yáng)性有149份，陽(yáng)性率為63.4%。劉琳［3］對(duì)中西部部分地區(qū)的未免疫規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行PRRSV ELISA 抗體檢測(cè)，得出陽(yáng)性率為84.46%；郝中香等［4］對(duì)四川省某個(gè)未免疫規(guī)?；i場(chǎng)的70 份血清進(jìn)行PRRSV ELISA抗體檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率為90%。本試驗(yàn)對(duì)PRRSV的陽(yáng)性檢出率均低于上述報(bào)道，說(shuō)明該場(chǎng)豬藍(lán)耳病感染沒(méi)有上述報(bào)道的嚴(yán)重，但陽(yáng)性率仍然較高，達(dá)到63.40%，應(yīng)引起豬場(chǎng)的高度重視。

4.2 RT-PCR 法被廣泛應(yīng)用于豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)，目前已成為實(shí)驗(yàn)室診斷藍(lán)耳病毒的主要手段。其主要優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，不用進(jìn)行病毒分離鑒定，省時(shí)、省力。但是在臨床實(shí)踐中，越來(lái)越多的藍(lán)耳病病毒開(kāi)放閱讀框（ORF）出現(xiàn)變異情況，針對(duì)不同開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)的引物的特異性不強(qiáng)，RT-PCR 診斷結(jié)果的差異較大。在整個(gè)藍(lán)耳病病毒基因組中，以O(shè)RF6 最為保守，可作為分子生物學(xué)鑒定的重要依據(jù)。因此，本試驗(yàn)選用ORF6 基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)采集的血液樣本進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得出陽(yáng)性率為5.26%。漆信橋［5］對(duì)四川省各地送檢的100 份血清樣本進(jìn)行藍(lán)耳病毒RT-PCR 檢測(cè)，得出陽(yáng)性率為34%；蔣劉柱［6］對(duì)四川綿陽(yáng)地區(qū)部分疑似發(fā)病豬場(chǎng)的78 份樣本進(jìn)行藍(lán)耳病毒RT-PCR 檢測(cè)，得出陽(yáng)性率為35.90%。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相比，陽(yáng)性檢出率較低，其原因可能與檢測(cè)樣本較少，缺乏代表性，或感染時(shí)間較長(zhǎng)，病毒血癥狀消失有關(guān)。