CTRP2與冠狀動(dòng)脈阻塞患者側(cè)支循環(huán)形成的臨床關(guān)聯(lián)及相關(guān)作用

湯 靜，于晨溪，陳中麗，章安迪

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200023

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》研究報(bào)告［1］顯示：心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位，高于腫瘤及其他疾?。恍难懿‖F(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中冠心病患者有1 100萬(wàn)。研究［2-3］表明，側(cè)支循環(huán)建立可以向阻塞的冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端提供逆向或前向血流灌注，起到保護(hù)心肌免于缺血和壞死的作用，改善血流動(dòng)力學(xué)，降低冠心病患者的死亡率。雖然冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的建立與冠心病患者較差的預(yù)后相關(guān)，但側(cè)支循環(huán)本身有利于緩解心絞痛癥狀，減少缺血損傷，同時(shí)有利于心肌梗死后血流的恢復(fù)［4-5］。M?bius-Winkler等［6］發(fā)現(xiàn)，每周10 h的中高密度鍛煉可以增加側(cè)支循環(huán)的建立，為冠心病患者提供潛在的血流灌注來(lái)源。外部反搏療法可以增加內(nèi)皮上的流體剪切應(yīng)力觸發(fā)動(dòng)脈生成，已被證明可延長(zhǎng)冠心病患者的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量［7］。這些研究表明，冠脈側(cè)支循環(huán)在冠狀動(dòng)脈阻塞患者中可發(fā)揮保護(hù)心肌的作用，同時(shí)促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成也成為治療冠心病、改善患者預(yù)后的新方法。

側(cè)支循環(huán)的形成包括2個(gè)主要過(guò)程：動(dòng)脈形成和血管新生［8］。由于冠狀動(dòng)脈阻塞，施加在側(cè)支內(nèi)皮上的流體剪切應(yīng)力增加，這是引起側(cè)支動(dòng)脈重塑的主要機(jī)制［9］。流體剪切應(yīng)力通過(guò)細(xì)胞膜上傳感器結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和黏附因子，促進(jìn)單核細(xì)胞激活并黏附于內(nèi)皮細(xì)胞［10］。單核細(xì)胞遷移到血管壁，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞并分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和側(cè)支血管的重塑［11］。當(dāng)側(cè)支血管半徑和壁厚增加使流體剪切應(yīng)力恢復(fù)到正常水平時(shí)，平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)停止［8］。激活的內(nèi)皮細(xì)胞也可在低氧誘導(dǎo)因子1-α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作用下，向缺氧部位遷移分裂，形成管腔，最終與阻塞冠脈遠(yuǎn)端形成吻合，建立血流［12-13］。

許多參與炎癥、早期轉(zhuǎn)錄及血管新生的基因與側(cè)支循環(huán)形成有關(guān)［14］。已報(bào)道［15］脂聯(lián)素（adiponectin）可促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成。脂肪因子補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族（C1q/tumor necrosis factor-related proteins，CTRPs）是與脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)類似的一組蛋白，與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)［16-17］。CTRP家族至少包括15個(gè)成員，其中CTRP1表達(dá)水平與冠脈側(cè)支循環(huán)形成呈負(fù)相關(guān)，而CTRP3則可促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)形成［18-19］。但目前，關(guān)于CTRP2對(duì)側(cè)支循環(huán)的影響及調(diào)控機(jī)制了解有限，本研究主要探討CTRP2對(duì)于冠脈阻塞患者側(cè)支循環(huán)形成的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年9月—2019年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科住院并進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影確診為冠狀動(dòng)脈阻塞患者為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈主要血管（左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈）至少一支血管狹窄>50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>80歲者。②既往有冠狀動(dòng)脈介入治療病史或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者。③陳舊性心梗、嚴(yán)重心臟瓣膜病、嚴(yán)重心功能不全患者。④嚴(yán)重肝腎功能不全者。⑤有急、慢性炎癥性疾病及感染性疾病者。⑥近期手術(shù)或創(chuàng)傷的患者。⑦惡性腫瘤患者。⑧有周圍血管疾病患者。最終篩選得到177名符合標(biāo)準(zhǔn)的患者。本研究經(jīng)過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者提供知情同意書。

1.2 冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)情況分級(jí)

依據(jù)Rentrop分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［2］，對(duì)177例冠狀動(dòng)脈阻塞患者根據(jù)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)情況進(jìn)行分級(jí)，由低到高分為0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)。評(píng)分越高，表明側(cè)支循環(huán)越豐富。本研究將0級(jí)、1級(jí)設(shè)為側(cè)支循環(huán)形成不良組，共89例；2級(jí)、3級(jí)設(shè)為側(cè)支循環(huán)形成良好組，共88例。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)CTRP2

在征得患者知情同意后，抽取患者外周靜脈血5 mL，置于含肝素的抗凝管中，立即于室溫下以2 012.4×g離心15 min，確認(rèn)無(wú)溶血后抽取上層血漿于-80℃凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血漿CTRP2表達(dá)水平，試劑盒由美國(guó)Aviscera Bioscience公司提供。

1.4 動(dòng)物模型建立

清潔級(jí)C57BL/6小鼠12只（體質(zhì)量20～22 g，4周齡），購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK（滬）2013-0018。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。通過(guò)手術(shù)方式完全結(jié)扎12只小鼠下肢股動(dòng)脈，建立下肢缺血模型。隨機(jī)選擇6只小鼠作為對(duì)照組，另外6只小鼠作為CTRP2過(guò)表達(dá)組并于結(jié)扎區(qū)域局部注射CTRP2過(guò)表達(dá)慢病毒（4個(gè)區(qū)域點(diǎn)）。分別于結(jié)扎后即刻、7 d、14 d及21 d，通過(guò)激光多普勒儀測(cè)定血供恢復(fù)情況，并計(jì)算血供恢復(fù)比率。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞成血管遷移

使用重組CTRP2蛋白，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，按照臨床檢測(cè)結(jié)果以50、100及200 pg/mL的劑量刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞8 h后，于Matrix Gel上檢測(cè)血管環(huán)形成能力，并通過(guò)Transwell檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力，以觀察其對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

研究資料統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。定量資料以x±s表示，定性資料以頻數(shù)（百分率）表示。首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象臨床特征

研究對(duì)象的年齡、性別及相關(guān)危險(xiǎn)因素特征如表1所示?？傮w上，側(cè)支循環(huán)形成良好與形成不良的患者在年齡、性別及冠心病相關(guān)危險(xiǎn)因素上差異未顯示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 研究對(duì)象的臨床特征Tab 1 Clinical featuresof the study population

2.2 不同側(cè)支循環(huán)冠狀動(dòng)脈阻塞患者CTRP2表達(dá)含量的差異

相比于側(cè)支循環(huán)形成良好的患者，側(cè)支循環(huán)形成不良的患者CTRP2有顯著性下降（圖1）（P=0.009）。而針對(duì)CTRP2與冠狀動(dòng)脈阻塞患者側(cè)支循環(huán)評(píng)分的相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析則顯示，CTRP2對(duì)側(cè)支循環(huán)形成不良的風(fēng)險(xiǎn)比OR=0.889，95%CI0.844～0.936，P=0.000；提 示CTRP2表達(dá)水平升高可能與冠狀動(dòng)脈阻塞患者側(cè)支循環(huán)形成不良風(fēng)險(xiǎn)的降低相關(guān)。

圖1 CTRP2在不同側(cè)支循環(huán)冠狀動(dòng)脈阻塞患者中的表達(dá)含量Fig 1 Expression level of CTRP2 in patients having coronary artery obstruction with different collateral growth

2.3 CTRP2對(duì)于小鼠下肢缺血模型血供恢復(fù)的作用

下肢結(jié)扎可顯著性抑制小鼠下肢血供。相比于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)CTRP2組小鼠，下肢動(dòng)脈結(jié)扎后14 d及21 d血供恢復(fù)比率高于陰性對(duì)照（均P<0.05），說(shuō)明CTRP2促進(jìn)小鼠下肢缺血模型的血供恢復(fù)（圖2）。

圖2 CTRP2對(duì)于小鼠下肢缺血模型血供恢復(fù)作用Fig 2 Effect of CTRP2 on blood supply restoration in the mouse model of lower limb ischemia

2.4 CTRP2對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管遷移的影響

重組CTRP2刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞血管環(huán)形成能力和內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力顯著高于培養(yǎng)基對(duì)照組，且與CTRP2濃度呈正相關(guān)（均P<0.05）（圖3）。

圖3 CTRP2對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響Fig 3 Effect of CTRP2 on thefunction of vascular endothelial cells

3 討論

目前關(guān)于CTRP2的相關(guān)研究較少，特別是針對(duì)其與側(cè)支循環(huán)以及血管新生的相關(guān)研究尚缺乏。本研究旨在探索CTRP2對(duì)冠狀動(dòng)脈阻塞患者中側(cè)支循環(huán)形成的臨床關(guān)聯(lián)，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞研究證明CTRP2具有潛在的促側(cè)支循環(huán)形成作用。研究發(fā)現(xiàn)：在冠狀動(dòng)脈阻塞患者中側(cè)支循環(huán)良好患者相較于側(cè)支循環(huán)不良患者血漿CTRP2表達(dá)水平升高，CTRP2對(duì)于缺血后側(cè)支循環(huán)具有明顯的改善作用，且CTRP2在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管及遷移。

既往研究［18］發(fā)現(xiàn)CTRP1在體外抑制上皮干細(xì)胞血管新生從而抑制側(cè)支形成，臨床研究［20］也證實(shí)了CTRP1與側(cè)支循環(huán)形成呈負(fù)相關(guān)。Akiyama等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，CTRP3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促增殖、遷移作用，促增殖作用能被絲裂原活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）1抑制劑和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制劑所抑制，而促遷移作用僅能被胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2抑制劑阻斷，表明該信號(hào)通路在CTRP3促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中起著重要作用。另一篇關(guān)于CTRP3的研究［22］表明CTRP3可能通過(guò)增加絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，Akt）的活性，誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管生成因子來(lái)發(fā)揮其血管生成作用。CTRP9通過(guò)脂聯(lián)素受體激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/Akt信號(hào)通路，繼而激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelia nitric oxide synthase，eNOS）發(fā)揮促血管生成作用，形成側(cè)支循環(huán)［23］。

先前研究［24］說(shuō)明CTRP2在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。Lei等［25］的研究發(fā)現(xiàn)Ctrp2基因敲除小鼠通過(guò)上調(diào)脂解酶的表達(dá)，促進(jìn)脂肪組織脂解作用，肝臟三酰甘油分泌增加，肝臟大小和肝三酰甘油水平顯著降低，但血漿三酰甘油卻升高，進(jìn)一步說(shuō)明了CTRP2在脂質(zhì)代謝中的重要作用?；诖?，已有研究［26］探討CTRP2表達(dá)水平與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系。但是CTRP2對(duì)于側(cè)支循環(huán)建立的作用及分子機(jī)制仍不明。本研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈阻塞患者血漿CTRP2表達(dá)水平與冠脈側(cè)支循環(huán)形成呈正相關(guān)；進(jìn)一步動(dòng)物模型通過(guò)結(jié)扎小鼠下肢，壓迫血管造成下肢動(dòng)脈阻塞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CTRP2組小鼠血供恢復(fù)比率高于陰性對(duì)照組；最后細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明CTRP2可能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成血管和遷移作用，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成，但CTRP2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成血管和遷移的具體分子機(jī)制仍有待研究。

綜上所述，冠心病患者中側(cè)支循環(huán)建立良好患者相較于側(cè)支循環(huán)不良患者血漿CTRP2表達(dá)水平升高；CTRP2于動(dòng)物體內(nèi)促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成改善血供，于體外增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞成血管和遷移能力；因此CTRP2可能具有調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈阻塞患者側(cè)支循環(huán)生成的作用，有望成為改善患者側(cè)支循環(huán)的潛在靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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