牛乳中脂肪酶活力檢測方法與影響因素研究

陳柏錫，黃艷艷，曾燕萍，李 斌，鄒蘭鈺，彭遠霞，張 偉

（四川新希望乳業(yè)有限公司洪雅陽平分公司，四川眉山 620000）

超高溫滅菌乳（Ultra High Temperature，UHT乳）經(jīng)過短時高溫的滅菌后，產(chǎn)品達到商業(yè)無菌的狀態(tài)，因此UHT乳具有保質(zhì)期長、可常溫儲運等特點[1]。但超高溫滅菌乳在儲存過程中會出現(xiàn)風(fēng)味異常、脂肪上浮等問題，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)和貨架期，該現(xiàn)象的主要原因是由UHT乳中脂肪酶導(dǎo)致的。牛乳中的脂肪酶主要有兩種來源，一種是天然存在于生乳中，稱為天然脂肪酶；另一種是牛乳中的微生物代謝所產(chǎn)生，稱為微生物脂肪酶[2]。牛乳中的微生物脂肪酶主要來源于嗜冷菌，雖然嗜冷菌本身的繁殖不會嚴(yán)重影響牛乳的穩(wěn)定性，且在較為溫和的熱處理中（如巴氏殺菌）也容易將其殺死，但某些嗜冷菌的代謝產(chǎn)物是耐熱脂肪酶，耐熱脂肪酶在經(jīng)過巴氏殺菌甚至超高溫滅菌后，仍不能被完全滅活。殘留的脂肪酶會分解牛乳中的脂肪，造成脂肪上浮和風(fēng)味異常，嚴(yán)重破壞滅菌乳的口感和風(fēng)味，導(dǎo)致滅菌乳的貨架期大幅縮短[3]。所以需要一種能夠快速、準(zhǔn)確且價廉的檢測方法檢測原料乳中脂肪酶的活力以及探究牛乳中脂肪酶活力的變化規(guī)律。

4-硝基苯基辛酸酯（PNP-C）在脂肪酶的作用下會產(chǎn)生在316 nm處有吸光度的物質(zhì)，根據(jù)比爾-朗博定律，在一定濃度下，吸光度大小與吸光度物質(zhì)濃度呈正比，實驗在底物濃度相同的情況下，產(chǎn)生吸光物質(zhì)濃度與脂肪酶活力成正比。本實驗使用脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度的脂肪酶溶液，分解底物產(chǎn)生吸光度后標(biāo)定曲線，以此測定樣品中脂肪酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

樣品來源于HN、ZX、ZN和XN共4家牧場生乳；5 U/mL脂肪酶溶液、5 mmol/L4-硝基苯基辛酸酯底物溶液、50 mmol/L pH7.2磷酸緩沖液、終止液：將乙腈與甲酸按照12∶1的比例混勻即可作為終止液。

1.1.2 儀器

紫外分光光度計、水浴加熱器、冷凍離心機、移液槍、移液管、水相濾頭（0.22 μm）等。

1.2 實驗步驟

將5 U/mL脂肪酶溶液配制成100 mU/mL的脂肪酶稀釋液備用，分裝好的底物在室溫下用流水解凍。取20 mL原料奶于50 mL離心管中，于10 000 r/min離心脫脂15 min。離心后將上層脂肪撇去，吸取100 μL清液于900 μL磷酸緩沖液中，混勻，制成1 mL樣品處理液。分別吸取300 μL樣品處理液于兩個2 mL離心管中，其中一個為加標(biāo)樣，并向兩個離心管中分別加入180 μL和120 μL磷酸緩沖液，并向加標(biāo)樣的離心管中加入60 μL 100 mU/mL脂肪酶稀釋液，最后向離心管中各加入120 μL底物溶液，制成待測樣品和加標(biāo)樣品。

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取4個2 mL離心管，每個離心管加入480 μL、450 μL、420 μL 和 360 μL 磷酸緩沖液，向離心管中加入 120 μL 底物和 0 μL、30 μL、60 μL 和 120 μL 脂肪酶稀釋液，混勻后即制成0 mU/mL、5 mU/mL、10 mU/mL和20 mU/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線置于44 ℃水浴加熱1 h取出，向每個離心管中加入1.3 mL終止液，搖勻，即可上機檢測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，樣品中脂肪酶活力見表1。由HN、ZX、ZN 3批原料奶的吸光度計算出樣品中的脂肪酶活力，再根據(jù)加標(biāo)回收率折算出樣品中脂肪酶活力準(zhǔn)確值。需注意的是，樣品的回收率應(yīng)在50%以上（如表1），當(dāng)回收率偏低時，有可能是離心效果不佳，導(dǎo)致脂肪剩余過多導(dǎo)致的，其原因是樣品中的脂肪酶不僅會與底物反應(yīng)，還會與牛乳中剩余的脂肪反應(yīng)，在相同的反應(yīng)時間內(nèi)，剩余脂肪的含量越高，導(dǎo)致產(chǎn)生吸光物質(zhì)的濃度比理論值越低，影響檢測結(jié)果。原料乳離心脫脂率通常為90%～95%。為補償剩余脂肪產(chǎn)生的影響，每個樣品必須進行平行試驗和加標(biāo)回收。

表1 通過加標(biāo)回收率回推樣品中脂肪酶活力

圖1 脂肪酶活力檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 原奶儲運時間對脂肪酶活力的影響

牛乳中耐熱脂肪酶是部分嗜冷菌的代謝產(chǎn)物，在冷藏條件下，隨著嗜冷菌的繁殖與代謝，牛乳中的脂肪酶活力應(yīng)隨之升高。本次實驗取兩個不同牧場的原料奶各5份，置于2～6 ℃條件下冷藏避光保存，每隔24 h對其脂肪酶活力和嗜冷菌數(shù)量進行檢測，繪制出的結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 HN牧場原料奶中脂肪酶活力與嗜冷菌數(shù)量與存放時間關(guān)系

圖3 ZX牧場原料奶中脂肪酶活力與嗜冷菌數(shù)量與存放時間關(guān)系

由圖2、圖3知，隨著儲存時間的增加，兩個牧場的原料乳中嗜冷菌總數(shù)均逐漸上升，48 h后嗜冷菌增長速度均大幅提高，脂肪酶活力在72 h達到最高點，并在此之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢，其原因是牛乳酸度的升高抑制了脂肪酶的活性。

在乳品生產(chǎn)加工的供應(yīng)鏈體系中，原料奶的運輸時長會隨著牧場與工廠距離的增加而增加，跨省牧場的運輸時間在20 h以上，運輸溫度均在4 ℃，原奶運輸過程可近似理解為低溫儲存的過程，本次實驗對省外牧場與省內(nèi)牧場的原料奶進行脂肪酶檢測，并統(tǒng)計其數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，省外牧場與省內(nèi)牧場的原料奶中脂肪酶活力均基本呈現(xiàn)正態(tài)分布，省外牧場的脂肪酶活力多數(shù)在8～11 mU/mL（平均值9.47 mU/mL），省內(nèi)牧場的脂肪酶活力普遍在5～8 mU/mL（平均值6.73 mU/mL），省外牧場奶源的脂肪酶活力明顯高于省內(nèi)牧場奶源，與原奶冷藏實驗得到的結(jié)論一致。

圖4 省內(nèi)外牧場脂肪酶活力對比

2.2 脫冷儲運對脂肪酶活力的影響

奶車運輸和原奶在工廠的奶倉中儲存均在4 ℃左右，當(dāng)奶車運輸或原奶儲存出現(xiàn)脫冷時（10～15 ℃），也會對原料奶的質(zhì)量造成影響[4]，取相同批次的XN牧場原料乳，分別在2～6 ℃與10～15 ℃環(huán)境中保存，模擬奶車正常運輸與脫冷的狀態(tài)，其脂肪酶檢測結(jié)果如圖5所示。當(dāng)運輸或儲存出現(xiàn)脫冷時，脂肪酶活力上升的速度也明顯增加。在最高點時（72 h），脫冷條件下的脂肪酶活力也明顯高于冷藏條件。

圖5 原料乳脫冷對脂肪酶活力的影響

2.3 脂肪酶活力對UHT滅菌乳的影響

UHT產(chǎn)品由于其經(jīng)過了超高溫滅菌工藝，經(jīng)過無菌灌裝后，產(chǎn)品內(nèi)部實現(xiàn)商業(yè)無菌狀態(tài)，因此UHT產(chǎn)品可在常溫下儲存，且保質(zhì)期較長，通?？蛇_到6個月。但UHT產(chǎn)品在儲存時經(jīng)常會出現(xiàn)脂肪上浮、風(fēng)味異常、口感變差等情況，這類情況會嚴(yán)重影響產(chǎn)品的貨架期，并影響消費者的購買體驗。原料奶中產(chǎn)生的耐熱脂肪酶在經(jīng)過超高溫滅菌后，仍然不能被完全滅活，這部分脂肪酶會持續(xù)分解乳脂肪，產(chǎn)生脂肪酸，引起脂肪上浮或氧化味[5]。本次實驗選取不同梯度的脂肪酶活力的原料奶，將其對應(yīng)的UHT成品進行常溫儲存，模擬貨架陳列。感官品評小組在10 d、20 d、30 d、60 d、90d和120 d后進行口感品評，客觀的記錄其風(fēng)味，其感官結(jié)果見圖6。

圖6 不同脂肪酶活力對成品風(fēng)味的影響

由圖6可知，當(dāng)脂肪酶活力處于較高水平時（10 mU/mL以上時），對應(yīng)成品儲存30 d時出現(xiàn)了奶香味不足、滋味寡淡的情況，在60 d時，脂肪酶活力處于8.0～10.0 mU/mL的實驗組出現(xiàn)了奶香味不足的現(xiàn)象，而脂肪酶活力最高的實驗組（＞13 mU/mL）則出現(xiàn)了輕微的豆腥味，經(jīng)分析應(yīng)該是脂肪分解后，部分脂肪酸輕微氧化產(chǎn)生的異味。而脂肪酶水平最低的1組在120 d內(nèi)，其滋氣味均處于正常水平。在第90 d，除脂肪酶活力最低的1組外，其余3組均出現(xiàn)了異味。由實驗結(jié)果可明顯看出，脂肪酶會明顯的影響成品中脂肪的分解速度，脂肪酶活力越高，分解脂肪酶的速度也越快，導(dǎo)致脂肪酸快速氧化，產(chǎn)生異味。

3 結(jié)論

牛乳中嗜冷菌代謝的耐熱脂肪酶不會被超高溫滅菌工藝完全滅活，殘留的脂肪酶會持續(xù)分解成品乳中的脂肪，縮短產(chǎn)品貨架期[6]。經(jīng)實驗表明，原料奶中脂肪酶活力越高，對應(yīng)成品的風(fēng)味變化越快，越容易產(chǎn)生脂肪氧化的豆腥味或陳腐味。原料奶中的脂肪酶活力隨著儲運時長的增加而不斷提高，在72 h后降低，即使在輕微脫冷的情況下，脂肪酶活力的上升速度也會明顯提高，所以在供應(yīng)鏈系統(tǒng)中縮短運輸、儲存時間是控制脂肪酶活力的有效手段，對奶車的運輸和原奶的儲存溫度的監(jiān)控也至關(guān)重要。另外，供應(yīng)鏈上游的奶源基地的衛(wèi)生條件直接影響了牛乳中的微生物指標(biāo)，奶源基地良好的衛(wèi)生條件是保證原料奶中較低嗜冷菌數(shù)量和較低脂肪酶活力的必要條件。