高效液相色譜法測(cè)定肉制品中胭脂紅的不確定度評(píng)定

周秀娟

（貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽 550014）

胭脂紅，又名食用赤色102號(hào)，為水溶性偶氮類人工合成著色劑。作為食品色素，胭脂紅可用于果汁飲料、配制酒、碳酸飲料和糖果等食品的著色，而肉干、肉脯制品、水產(chǎn)品等食品中是不允許添加的，但胭脂紅在食品中過量添加或違規(guī)添加的食品安全事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康與安全。本文參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《肉制品 胭脂紅著色劑測(cè)定》（GB/T 9695.6—2008）[1]HPLC法，對(duì)肉制品中胭脂紅測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市場(chǎng)購買腌臘肉。胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為0.5 mg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）、水（二級(jí)水）、甲醇（色譜純）、甲酸、石油醚、無水乙醇、鎢酸鈉、檸檬酸和乙酸銨。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）、色譜柱、精密天平、恒溫水浴鍋、聚酰胺小柱和超聲波清洗機(jī)。

1.3 分析方法

整個(gè)檢測(cè)過程均在（20±5）℃環(huán)境條件下進(jìn)行。

1.3.1 前處理過程

采用萬分之一天平稱取5.0 g肉制品樣品，置于50 mL離心管中，加30 mL石油醚，攪拌、靜置，棄去石油醚，去除脂肪。加無水乙醇+氨水+水，溶液提取胭脂紅，收集提取液于250 mL錐形瓶中，70 ℃水浴濃縮至約10 mL，加入1 mL硫酸溶液和1 mL鎢酸鈉溶液，混勻，繼續(xù)70 ℃水浴5 min，取上清液全部過聚酰胺小柱，用約15 mL甲醇-甲酸水淋洗，最后用15 mL無水乙醇+氨水+水洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用水定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用高校液相色譜檢測(cè)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)508 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程

（1）50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。用1 mL的分度吸量管流出式（A級(jí)）從0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取1 mL于10 mL的單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）中，用水定容至刻度。

（2）配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL 和 8.0 μg/mL。①8.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取0.8 mL于5 mL容量瓶中，用水定容。②5.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取1 mL于10 mL 容量瓶中，用水定容。③ 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 配 制。 用 1 mL 分 度 吸量管從5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL于4個(gè)1 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.4 重復(fù)測(cè)定與加標(biāo)回收率

按照1.3中前處理方法和色譜條件。取一陽性樣品，在重復(fù)性條件測(cè)定6次，取平均值為最終檢測(cè)結(jié)果；采用陰性樣品添加濃度為3 μg/mL進(jìn)行回收率試驗(yàn)，測(cè)定6次計(jì)算其回收率。

2 數(shù)學(xué)模型

試樣中胭脂紅含量的數(shù)學(xué)模型為：

式（1）中，x-試樣中胭脂紅的含量，單位mg/kg；c-從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的試樣溶液中胭脂紅的濃度，單位μg/mL；v-待測(cè)樣液最終定容體積，單位mL；m-待測(cè)樣品質(zhì)量，單位g；-加標(biāo)回收率校正因子。

3 不確定度來源分析

從測(cè)定過程和數(shù)學(xué)模型分析，胭脂紅含量測(cè)定的不確定度來源有：①標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(c)；②樣品稱樣量引入的不確定度urel(m)；③樣品最終定容體積引入的不確定度urel(v)；④樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度urel(x)；⑤測(cè)量回收率校正因子引入的不確定度urel(R)[2]。

4 不確定度的評(píng)定

4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度分為標(biāo)準(zhǔn)溶液定值、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的稀釋、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合4個(gè)部分。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液定值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c1)。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供信息得知，標(biāo)液濃度為0.5 mg/mL，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%（k=2），即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（2）稀釋得到50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)不確定度urel(c2)。該不確定度包括定容時(shí)容器的容量和環(huán)境溫度變化兩方面引入的不確定度。按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJF 196—2006）[3]規(guī)定的容量允許誤差，定容時(shí)玻璃器具容量誤差見表1，因溫度變化產(chǎn)生的誤差見表2。按三角分布，即

表1 容量誤差

表2 溫度變化誤差

定容過程中，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度波動(dòng)為±5 ℃。20 ℃時(shí)，水的膨脹系數(shù)2.1×10-4℃，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5℃，則：

式中：α水-水的膨脹系數(shù)，α玻璃-玻璃的膨脹系數(shù)，v20-20 ℃時(shí)誰的體積，T溫度，Δv-水的體積差。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c3)。根據(jù)1.3.3配制過程中使用的一系列玻璃量具，其產(chǎn)生相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表3和表4。

表3 容量誤差

表4 溫度變化誤差

由容量誤差引入的合成相對(duì)不確定度

因環(huán)境溫度變化引入的合成相對(duì)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生不確定度[4]urel(c4)。用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積曲線，分別測(cè)定6種質(zhì)量濃度的胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)液 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL和8.0 μg/mL，每種質(zhì)量濃度測(cè)定2次，得到相應(yīng)的峰面積A測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線結(jié)果

重復(fù)測(cè)定樣品6次，將其峰面積代入線性回歸方程計(jì)算測(cè)定濃度，再根據(jù)公式（1）計(jì)算待測(cè)物含量，其由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(c4)。

峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差s為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度

4.2 樣品的稱量產(chǎn)生的不確定度urel(m)

根據(jù)JJG 1036—2008，其最大允許誤差±1 mg，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度稱樣質(zhì)量為5.001 2 g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.3 樣品的最終定容體積產(chǎn)生的不確定度urel(v)

根據(jù)1.3.1中前處理方法，最終定容體積為10 mL，產(chǎn)生不確定度如下。

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）環(huán)境溫度變化引起溶劑體積變化，玻璃容量瓶體積的變化。

Δv=v1-v20=(a水-a玻璃)×v×(T1-T2)，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.4 樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度通過重復(fù)性檢測(cè)評(píng)定urel(x)

該不確定度為A類不確定度，按照1.3的分析方法對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性條件測(cè)試結(jié)果

4.5 加標(biāo)回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

按照1.3.1的前處理方法進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，回收率（R）測(cè)定結(jié)果見表7，該不確定度為A類不確定度。

回收率R/（%）平均回收率R/（%）1 0 6.0 1 0 5.0 9 8.8 1 0 3.0 9 9.5 1 0 4.0 1 0 3.0

為了確定回收率是否計(jì)入研制和含量的計(jì)算中，將回收率進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，說明與1.0無顯著性差異，則計(jì)算中不需采用回收率校正因子對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正，回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度不應(yīng)納入合成不確定度的計(jì)算[5]。

4.6 擴(kuò)展不確定度評(píng)定和測(cè)定結(jié)果表示

5 結(jié)論

從對(duì)肉制品中胭脂紅測(cè)量不確定度的分析可看出，每一步操作都會(huì)產(chǎn)生測(cè)量不確定度，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品重復(fù)性測(cè)量、加標(biāo)回收引入的不確定度較大。標(biāo)液的配制、稀釋、標(biāo)線的配制過程中，過程越復(fù)雜、使用器具越多，最后產(chǎn)生的不確定度越大。樣品重復(fù)性測(cè)量產(chǎn)生不確定較大，可以通過關(guān)注固相萃取柱的回收率、提高樣品的均勻性及人員的操作技能減小測(cè)量結(jié)果的不確定度。