陳佩佩,陳琳珊,陳 茹
(1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室,廣東廣州 511442;2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司,廣東廣州 511442;3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗站,廣東廣州 511442)
黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的一類次生代謝物[1],從化學結構上,均屬于雙呋喃香豆素衍生物,是一類毒性極強的雙呋喃環(huán)類毒素。由于AFT產(chǎn)生菌在自然界中廣泛存在,很多的動植物源性食品都有可能存在污染[2],尤其在植物的種植、加工、運輸、儲存等過程都有可能被產(chǎn)生菌污染,從而產(chǎn)生毒素[3]。同時,黃曲霉毒素在自然條件下穩(wěn)定性較強,極性較低,難以用水或紫外線完全除去,只有在強堿性條件下容易分解[4],過多的攝入引起致癌、致畸和致突變等毒性效應[5],其中以黃曲霉毒素B1的毒性致癌性最強。近年來,我國黃曲霉毒素污染事件頻繁發(fā)生,因此,建立高效、通用、靈敏的相關檢測方法,對企業(yè)生產(chǎn),消費者安全都有十分重要的意義。
目前,國內(nèi)外對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]或液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[10]、免疫學檢測法[11-12]。高效液相色譜法操作煩瑣,盡管檢測器靈敏度高,但雜質(zhì)多,分析時間較長,免疫學檢測法雖然能大批量檢測,但易與類似結構的化合物發(fā)生反應,出現(xiàn)假陽性,結果偏差較大。質(zhì)譜法應用較廣,前處理簡單,定性定量能力好,但高分辨質(zhì)譜價格昂貴,難以廣泛應用。本文以分散液液微萃取為前處理手段,建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對茶飲料中的黃曲霉毒素B1和B2進行測定。方法學驗證結果表明,方法整體方便快捷,靈敏度高,回收率好,可日常大批量檢測。
API4000Q質(zhì)譜儀、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)、4k-15離心機、IKA Vortex4渦旋混勻器、Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)。
茶飲料,廣州市售;黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2,純度大于98%,德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷,均為HPLC級,美國Thermo Fisher公司;鹽酸、磷酸鈉,均為分析純,廣州試劑廠;實驗用水為Milli-Q超純水。
于15 mL尖底離心管中加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混勻,然后加入5 mL樣品,渦旋提取10 min,使用1 mol/L的磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6,渦旋混勻后置于離心機中以4 500 r/min離心5 min,使3-氯苯胺沉淀。除去上層水相,下層3-氯苯胺用乙腈定容至200 μL,待測定。
標準儲備溶液:分別準確稱取黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2標準品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中,用乙腈稀釋成500 mg/L的儲備液。
標準中間溶液:用乙腈將上述儲備液稀釋成濃度為10 mg/L的標準中間液。
溶劑曲線:使用乙腈配制成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 和 100 μg/L 的標準使用液,繪制校準曲線。
基質(zhì)曲線:使用空白烏龍茶基質(zhì)液配制校準曲線,濃度點與溶劑曲線相同。
1.5.1 色譜條件
色譜柱:Xbridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.0 μm);進樣體積:10 μL;流速0.5 mL/min;柱溫:35 ℃;流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B);等度洗脫程序:0.0~5.0 min,75% A。
1.5.2 質(zhì)譜條件
離子源:ESI源;離子化模式:電噴霧電離源正模式(ESI+);氣簾氣壓:241 kPa;毛細管電壓:5 500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣壓力:345 kPa;加熱輔助氣壓力:345 kPa;碰撞氣(CAD):中等;采集模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式。
根據(jù)黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的化學結構,其含有較多含O基團,在離子化過程中傾向于得到質(zhì)子,因此分別以其相對分子質(zhì)量加上H+質(zhì)量,初步確定母離子質(zhì)荷比。以混合流動相的流動注射的方式向離子源注射標準溶液,在m/z313.1和m/z315.1處,均得到較高響應的[M+H]+離子,同時以多反應監(jiān)測(MRM)模式采集二級碎片。進一步優(yōu)化去簇電壓DP和碰撞電壓CE,得到較優(yōu)響應,二級質(zhì)譜圖見圖1,詳細質(zhì)譜信息見表1。
表1 黃曲霉毒素B1、B2質(zhì)譜數(shù)據(jù)
圖1 黃曲霉毒素的二級質(zhì)譜圖
分散液液微萃取過程中,加入分散劑和待測樣液互溶,加入萃取劑振蕩形成微小的液滴,這些液滴在移動的過程中于對目標物進行連續(xù)萃取,形成水/分散劑/萃取劑形成均相乳濁液體系,快速完成分析物在水溶液與萃取劑之間的分配平衡。選擇鹽酸作為分散劑。在本實驗中,當分散劑用量小于0.6 mL時,提取回收率低于70%,使用量為1.0 mL時,回收率達到最高,隨著使用量提高至1.2 mL,回收率有所回降。所以鹽酸分散劑用量選取為1.0 mL。詳細結果見圖2。
圖2 分散劑體積對回收率的影響
在分散劑體積為1 mL的條件下,分別用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺進行萃取,考察了不同體積的萃取劑對萃取回收率的影響,結果如圖3所示。隨著3-氯苯胺體積增大,回收率也增大,而當體積大于50 μL時,回收率增大不明顯,而且3-氯苯胺的使用體積越大,pH回調(diào)的幅度也越大,實驗更耗時,最終定容液3-氯苯胺的占比也越大,對于含有甲酸的流動相體系,容易造成溶劑效應,使峰型變差。因此,最終確定3-氯苯胺50 μL為最佳萃取體積。
圖3 萃取劑體積對回收率的影響
市售的茶飲料會添加糖、色素、酸度調(diào)節(jié)劑或其他添加劑,且含量遠超于黃曲霉毒素可能存在的含量,加上茶葉本身含有較多的天然物,因此有可能造成較嚴重的基質(zhì)效應(ME),使定量結果偏差較大。為了探究實驗實際存在的基質(zhì)效應,分別用空白基質(zhì)液和乙腈配制了基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€,并以基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€的斜率比ME值為判斷依據(jù),當ME在80%~120%時,則說明基質(zhì)效應不明顯。實驗結果顯示,黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的ME值分別為23.2%和26.5%,說明基質(zhì)負效應明顯,因此最終選擇使用基質(zhì)曲線進行定量,以校正基質(zhì)效應造成的偏差。
使用空白基質(zhì)溶液配制標準曲線,線性范圍為1.0~100 μg/L,將該曲線于優(yōu)化后的條件下測定,以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線。同時以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分別確定方法的檢測限與定量限。黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2定量離子流圖見圖4。
圖4 黃曲霉毒素提取離子流色譜圖
結果表明,黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的相關系數(shù)r分別為0.999 6和0.999 3,基質(zhì)曲線方程分別為Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750,檢測限均為20.0 ng/kg,定量限均為50.0 ng/kg。由分析結果可知,本方法定量能力好,檢出限低,可有效對茶飲料中的黃曲霉毒素進行定量分析。
分別對市售的3種茶飲料(綠茶、烏龍茶、紅茶)進行測定,結果均為陰性。使用該樣品進行加標回收實驗。每種樣品均按照定量限的1倍、2倍和10倍進行添加,即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg濃度水平,每個濃度水平在日內(nèi)平均測定6次,平均回收率和相對標準偏差結果見表2。
表2 加標回收率及相對標準偏差數(shù)據(jù)(n=6)
3種樣品的平均回收率范圍在71.2%~91.0%,RSD范圍在2.23%~6.43%,方法回收率、精密度及準確度良好,可用于實際樣品的測定。
以液液微萃取為基礎,建立前處理方法,方法整體高效簡單,通過調(diào)節(jié)pH,較大限度回收萃取劑,提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法,優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜條件,兩種黃曲霉毒素在樣3 min內(nèi)出峰,且峰型良好。使用基質(zhì)曲線對定量結果進行校準,降低了基質(zhì)效應對結果的影響?;厥章屎拖鄬藴势顢?shù)據(jù)表明,方法靈敏度高、重現(xiàn)性好,可為茶飲料中毒素測定方法的開發(fā)提供依據(jù)。