一種甲基膦酸酯降解菌的篩選、鑒定以及特性分析

李俊紅，劉厚權(quán)，喻嬋

(省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室， 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢430062)

0 引言

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，有機(jī)磷產(chǎn)品的使用量日趨增大，水體富營養(yǎng)化以及土壤有機(jī)磷農(nóng)藥殘留情況日益嚴(yán)重.尤其是土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，有機(jī)磷農(nóng)藥可因食入、吸入或經(jīng)皮膚吸收而中毒[1].因此，了解有機(jī)磷在環(huán)境中的降解轉(zhuǎn)化有重要意義.有機(jī)磷是自然生態(tài)系統(tǒng)中磷循環(huán)的主要組成部分，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，絕大多數(shù)不能被生物體直接吸收利用，只有經(jīng)過生物或化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為以可溶性無機(jī)磷為主的有效磷才能被生物利用[2-4].在較長一段時間內(nèi)，人們對磷的地球化學(xué)循環(huán)研究主要集中在無機(jī)磷的生態(tài)利用及環(huán)境行為上，近些年有機(jī)磷的研究才逐步受到重視.目前，在對有機(jī)磷的環(huán)境行為研究中，研究者們普遍關(guān)注于環(huán)境介質(zhì)中復(fù)雜有機(jī)磷組分的鑒別和相互轉(zhuǎn)化、生物可利用磷的吸收和釋放，或者關(guān)注于具體的有機(jī)磷類污染物在環(huán)境介質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化行為以及環(huán)境要素和微生物對它們的作用影響等，均取得了大量研究成果[5-6].而利用微生物來降解污染物也逐漸引起人們的關(guān)注[7]，如假單胞菌屬[8]和副單胞菌屬[9]是成功用于污染環(huán)境中降解有機(jī)磷農(nóng)藥的主要微生物.

有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性無機(jī)磷的地球化學(xué)行為是磷循環(huán)中的重要一環(huán)，也是有機(jī)磷研究中的重要組成部分.在微生物作用下，有機(jī)磷可被降解成用于合成細(xì)胞物質(zhì)的無機(jī)磷酸鹽以及其他產(chǎn)物，同時環(huán)境中的無機(jī)磷可以直接被微生物利用，參與新陳代謝合成含磷物質(zhì)，隨其生命活動釋放到水體中，參與自然環(huán)境中的磷循環(huán)[4,10].因此，在有機(jī)磷的研究中，微生物降解的相關(guān)研究占有重要的地位.1973年，第一個能夠降解有機(jī)磷化合物的微生物被分離出來，并被鑒定為黃桿菌屬(Flavobacterium)[11].自此，開啟了有機(jī)磷微生物降解機(jī)制研究的大門.但是由于有機(jī)磷組分的復(fù)雜性，對有機(jī)磷遷移轉(zhuǎn)化分子機(jī)制的研究多集中于典型有機(jī)磷污染物[12-13]，不具有普遍性，選擇一種具有有機(jī)磷普遍結(jié)構(gòu)的簡單物質(zhì)作為有機(jī)磷遷移轉(zhuǎn)化分子機(jī)制研究的對象十分必要.甲基膦酸酯是一種結(jié)構(gòu)最簡單的磷酸酯，既是其他復(fù)雜有機(jī)磷分子生物合成的前體，也是多種有機(jī)磷分解的代謝產(chǎn)物，常作為代表性物質(zhì)用于研究有機(jī)磷基礎(chǔ)地球化學(xué)過程[14].

甲基膦酸酯可以作為菌株生長的唯一磷源[15-16]，本研究使用以甲基膦酸酯為唯一磷源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基從海南施用有機(jī)磷農(nóng)藥的圣女果培植基地土壤中篩選可以降解甲基膦酸酯的菌株，并進(jìn)行菌種鑒定.一共篩選到18株可以降解甲基膦酸酯的菌株，對其中生長較好的3株菌測定相同條件下生長曲線和培養(yǎng)基中無機(jī)磷的濃度曲線，選出降解效果最好的菌株進(jìn)行其生長及降解特性的研究.主要研究條件為溫度和pH對菌株生長和甲基膦酸酯降解的影響，設(shè)置18 ℃、28 ℃和37 ℃ 3種溫度探究其在pH為7的條件下以及pH為5、7、9和溫度為28 ℃條件下的生長情況以及甲基膦酸酯降解特性.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 甲基膦酸酯(Methylphosphonic acid)購于美國Sigma-Aldrich.Tryptone、Yeast extract購于OXOID.葡萄糖、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4、CoCl2，均為國藥公司提供.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：tryptone 10.0 g，yeast extract 5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL.121 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌.

含5 mmol/L甲基磷酸酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.207 8 g，KCl 0.273 0 g，(NH4)2SO43.000 0 g，MgSO4·7H2O 0.534 0 g，甲基膦酸酯 0.480 1 g，葡萄糖 10.000 0 g.加600 mL蒸餾水后使用NaOH調(diào)pH至7，蒸餾水定容至1 000 mL.用之前加0.1%(體積分?jǐn)?shù))的微量元素溶液，固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基額外添加15 g/L的瓊脂.108 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌.

微量元素溶液：MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.20 g，0.22 μm濾膜過濾除菌，避光4 ℃保存.

1.1.3 16S rRNA鑒定引物 使用16S rRNA通用引物，其序列為：

27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[17].

1.2 方法

1.2.1 土樣采集 土壤樣品采集于施用有機(jī)磷農(nóng)藥的圣女果培植基地，位于海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)米桶村.

1.2.2 樣品富集 將采集的土壤樣品分別置入無菌三角瓶中，加入適量無菌水，于28 ℃、250 r/min搖床振蕩打散均勻后，靜置30 min.取5 mL靜置后的上清液加入盛有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、250 r/min搖床振蕩3～5 d，然后取其中的5 mL接入新的50 mL滅菌LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d.

1.2.3 有機(jī)磷降解菌的篩選及培養(yǎng) 取富集后的培養(yǎng)液用無菌水分別稀釋10-4、10-5、10-6倍，取100 μL稀釋后的菌液在含有5 mmol/L甲基磷酸酯的無機(jī)鹽固體平板上涂勻，28 ℃培養(yǎng).待長出菌落后挑取單菌落，在新的含有5 mmol/L甲基磷酸酯的無機(jī)鹽固體平板上劃線分離，直到得到形態(tài)均一的單菌落.將長出的單菌落分別接種到pH 7，含有5 mmol/L甲基磷酸酯的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng).根據(jù)菌生長情況來篩選生長較好的菌株.

1.2.4 菌株鑒定 挑取含有5 mmol/L甲基磷酸酯的無機(jī)鹽固體平板上的單菌落，溶于10 μL無菌水中，使用該菌液作為模板，16S rRNA通用引物27F和1492R擴(kuò)增該細(xì)菌的16S rRNA序列.PCR體系為50 μL體系，菌液2 μL，引物各1.5 μL(引物濃度為10 μmol/L)，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，Pfu DNA聚合酶 2 μL，ddH2O 37 μL.PCR 反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min，98 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 5 min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序采用Sanger一代測序法.測序結(jié)果16S rRNA序列使用SnapGene拼接，將序列在NCBI上比對，根據(jù)同源性判斷其所屬.篩選到的18種菌株進(jìn)化樹圖使用軟件MEGA7鄰接法進(jìn)行分析.

1.2.5 菌株降解有機(jī)磷能力測定 甲基膦酸酯被微生物降解后產(chǎn)生磷酸鹽，使用磷鉬藍(lán)法檢測培養(yǎng)基中磷酸鹽的含量來評估菌株降解效果和正磷酸鹽的釋放情況，同時測定培養(yǎng)基在波長600 nm處吸光值制作生長曲線來判斷菌株生長情況.

1.2.6 磷鉬藍(lán)法 配制反應(yīng)液：3.000 g 鉬酸銨溶于100 mL ddH2O制成鉬酸銨溶液，70 mL H2SO4溶入430 mL ddH2O制成稀硫酸溶液，1.320 gL-抗壞血酸溶于50 mL ddH2O制成抗壞血酸溶液，0.034 g 酒石酸銻鉀溶于25 mL ddH2O制成酒石酸銻鉀溶液.將反應(yīng)液按比例混成Mix溶液(50 mL)：10 mL鉬酸銨溶液、25 mL稀硫酸溶液、10 mL抗壞血酸溶液、5 mL酒石酸銻鉀溶液，混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用.按反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，500 μL樣品+5.50 mL ddH2O+960 μL Mix溶液.體系混勻反應(yīng)5 min后測定反應(yīng)體系在波長880 nm處吸光值，使用ddH2O作為樣品的反應(yīng)溶液進(jìn)行空白對照校正.反應(yīng)之前使用KH2PO4作為標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株篩選鑒定結(jié)果 將5 mmol/L甲基膦酸酯無機(jī)鹽固體平板上分離純化得到的單菌落使用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，送公司測序獲得序列進(jìn)行16S rRNA鑒定，將16S rRNA序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，共得到18株菌株，如圖2所示.根據(jù)菌株在含有5 mmol/L甲基膦酸酯平板上的生長情況(表1)，選出較好的3株分別單獨培養(yǎng)，測定菌株在pH為7, 溫度為28 ℃下的生長曲線及培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放曲線，如圖3所示.在相同條件下，伯克氏菌屬的一株菌相對于其他菌生長狀態(tài)最好，培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放濃度最高，其最大OD600值達(dá)到3.2，培養(yǎng)基中釋放的無機(jī)磷濃度為290 μmol/L.NCBI網(wǎng)站比對16S rRNA結(jié)果與伯克氏菌相似性為99%，命名為Burkholderiastrain HQL1813.注冊16S rRNA GenBank登錄號為MK044746.1.為了后續(xù)研究及應(yīng)用，菌株HQL1813已于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813，保藏編號：CCTCC NO：M 2018708，保藏地址：中國武漢，武漢大學(xué).

圖3 生長較好的3株菌生長曲線和培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放濃度曲線培養(yǎng)基為含5 mmol/L甲基膦酸酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)體系為50 mL，培養(yǎng)條件為pH 7、28 ℃.對照為相同條件下空白對照，無明顯生長和甲基膦酸酯降解

表1 篩選得到的18種降解甲基膦酸酯的菌株生長情況

圖1 16S rRNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖1～18分別為不同單菌落16S rRNA序列擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，M：DNA Marker

圖2 篩選得到的18種降解甲基膦酸酯的菌株進(jìn)化樹圖

2.1.2 菌株Burkholderiastrain HQL1813形態(tài)特征觀察 伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813在含有甲基膦酸酯的無機(jī)鹽固體平板上劃線培養(yǎng)后單菌落為淡黃色的圓形，單菌落用水稀釋后革蘭氏染色被染成紫紅色，為革蘭氏陰性菌，呈棒狀，如圖4所示.

圖4 革蘭氏染色后顯微鏡下觀察(4 000倍)

2.2 菌株Burkholderiastrain HQL1813 降解MPn的特性分析

2.2.1 溫度對菌株的影響 配制含有5 mmol/L甲基磷酸酯(pH為7)的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)體系為50 mL，接種HQL1813后分別于18 ℃、28 ℃和37 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)，同時測定其生長曲線以及培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放曲線(圖5).

圖5 菌株Burkholderia HQL1813在不同溫度條件下培養(yǎng)時的生長曲線和培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放濃度曲線培養(yǎng)體系為50 mL(pH為7)

從圖5可以看出，該菌株在18 ℃和28 ℃培養(yǎng)時均可以生長，37 ℃不生長.在18 ℃培養(yǎng)時菌株生長較慢，直到100 h后才開始生長，140 h后進(jìn)入對數(shù)期，同時開始釋放磷酸鹽到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度為50 μmol/L.該菌株在28 ℃時生長情況最好，50 h后進(jìn)入對數(shù)期，并且釋放磷酸鹽到培養(yǎng)基中.隨著菌株的生長，28 ℃培養(yǎng)的菌株最大OD600值達(dá)到4.89，培養(yǎng)基中磷酸鹽逐漸積累，最大磷酸鹽濃度達(dá)到228 μmol/L.該菌株的最適生長溫度為28 ℃，18 ℃緩慢生長，37 ℃不生長.

2.2.2 pH對菌株降解MPn能力的影響 配制含有5 mmol/L甲基磷酸酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基體系為50 mL，pH分別調(diào)為5、7和9，接種HQL1813后于28 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)，同時測定其生長曲線以及培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放曲線(圖6).

圖6 菌株Burkholderia HQL1813在不同pH條件下生長曲線和培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放濃度曲線培養(yǎng)體系為50 mL，28 ℃

從圖6可以看出菌株BurkholderiaHQL1813在pH為5和7時均可以生長，而pH 9時無法生長.其中，培養(yǎng)基中磷酸鹽的釋放伴隨著整個生長周期并且逐漸累積.pH為7時菌株生長情況最好，最大OD600值達(dá)到2，pH為5時最大OD600值為1.5.pH 5時培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度最終達(dá)到90 μmol/L.pH為7時培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度最終達(dá)到120 μmol/L以上.該菌株最適生長pH為7，pH為5時相對生長情況較差，pH為9時不生長.

3 討論

目前，人們已分離出多種能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物菌群，細(xì)菌在微生物降解中占有重要地位，大多數(shù)分離到的細(xì)菌為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等.而Tiwari等[18]分離出一株對有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對硫磷有較好去除和降解效果的藍(lán)藻，Melissa等[19]也發(fā)現(xiàn)一株高溫聚球藻可以在以甲基膦酸酯為唯一磷源的培養(yǎng)基中生長.分離得到高效有機(jī)磷降解菌后可以使用基因工程手段來提高其降解效果，鄧敏捷等[20]從產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)中克隆得到有機(jī)磷降解基因ophc2并在大腸桿菌中驗證其生物學(xué)功能.另外，研究表明微生物降解有機(jī)磷有廣譜性，一種微生物可以降解多種有機(jī)磷.江玉姬[21]以及Kazufumi等[22]均發(fā)現(xiàn)了可以降解多種有機(jī)磷的菌株，Brajesh等[23]利用菌株EnterobacterB-14進(jìn)行了污染土壤修復(fù)的研究，表明微生物在土壤修復(fù)以及有機(jī)磷降解方面有潛在應(yīng)用[24].

本實驗從土壤樣品中，利用甲基膦酸酯作為唯一磷源篩選得到18株可以降解甲基膦酸酯的菌株，其中生長和降解效果最好的是Burkholderiastrain HQL1813.本研究對該菌株進(jìn)行了鑒定以及降解甲基膦酸酯特性分析，該菌株屬于伯克氏菌(Burkholderia),生長的最適溫度為28 ℃，最適pH為7.根據(jù)生長曲線和培養(yǎng)基中磷酸鹽釋放濃度曲線可以看出伯克氏菌(Burkholderia)HQL1813在含有甲基膦酸酯的培養(yǎng)基中生長良好，具有降解甲基膦酸酯的能力.該菌株在培養(yǎng)條件下80 h后最大OD600值可以達(dá)到4.89，在培養(yǎng)100 h后培養(yǎng)基中無機(jī)磷濃度達(dá)到228 μmol/L，能夠?qū)⒓谆姿狨ソ到鉃榱姿猁}.和其他降解菌報道[7]相比，本研究中磷酸鹽釋放率偏低，分析甲基膦酸酯被降解后只計算了釋放到培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化為無機(jī)鹽的部分，而微生物利用轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物量的部分未計算，同時培養(yǎng)基中有機(jī)磷濃度也可能影響其生長.該菌除了在有機(jī)磷土壤污染方面的潛在應(yīng)用外，還可以用于自然環(huán)境科學(xué)中磷的遷移變化規(guī)律、有機(jī)磷微生物降解機(jī)理的研究.