實(shí)驗(yàn)中丙烯酰胺控制損失關(guān)鍵點(diǎn)及方法優(yōu)化

李金莉 周冰谷

廣東省廣州市精益和泰質(zhì)量檢測股份有限公司 廣東廣州 510000

隨著生活的豐富與多元化使得人們開始重視食品的營養(yǎng)與質(zhì)量安全，食品的熱加工過程中產(chǎn)生的一系列物化反應(yīng)與改變食品組分的結(jié)構(gòu)和功能的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些不可忽視的有害物質(zhì)（如雜酰胺、丙烯酰胺）[1]。因此，在這里對丙烯酰胺的實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行了優(yōu)化及改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案。

1 實(shí)驗(yàn)過程的損失排查過程

1.1 樣品液上機(jī)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

GB5009.204-2014方法，由于做過程曲線的丙烯酰胺上機(jī)后內(nèi)標(biāo)及目標(biāo)物幾乎無響應(yīng)，所以需要排查原因，從人、物資、材料、方法、環(huán)境中分析，其它因素都相對穩(wěn)定，因此考慮優(yōu)先從實(shí)驗(yàn)方法著手分析無響應(yīng)的原因[2]。

1.2 實(shí)驗(yàn)損失排查（逐步排查法）

為了避免塑料制品中途帶入污染物，我們試驗(yàn)過程全程選用玻璃制品。

1.2.1 樣品制備（從第一步驟起考察目標(biāo)物流失）

根據(jù)GB5009.204-2014方法步驟，（玻璃器皿使用三角瓶或玻璃離心管）稱取1.00g樣及空白加標(biāo)，j加入超純水10ml，均質(zhì)后加入1mg/L13C3-丙烯酰胺400μL（最終20ppb內(nèi)標(biāo)，相當(dāng)于每克樣加入內(nèi)標(biāo)20ng）→振蕩混勻30min，離心（10min,4000rpm），用一次性槍頭吸取上清液200μL上機(jī)。→k凈化：（固相萃取柱凈化）向上清液加入5ml正己烷，振蕩萃取10min，離心，除去有機(jī)相，取200μL水相上機(jī)→l取5ml濾液過HLB小柱，收集流出液→m過BondElut-Accucat小柱，取200μL上機(jī)→n氮吹、0.1%甲酸溶液復(fù)溶、上機(jī)。

上機(jī)分析，步驟j樣品、空白加標(biāo)內(nèi)標(biāo)響應(yīng)均很低，因此考慮步驟j提取失敗，考慮更換提取試劑。

1.2.2 樣品制備方案改進(jìn)（從第一步驟起考察目標(biāo)物流失）

j改加10ml5mol/LNaCl溶液提取液上機(jī)后分析內(nèi)標(biāo)響應(yīng)更高，因此5mol/LNaCl溶液更適合做提取試劑。l過HLB小柱后的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)基本丟失，因此HLB小柱是除雜效果；mn內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回升，但仍然比過小柱前響應(yīng)弱很多。因此，盡管這個(gè)方法優(yōu)化提取試劑外，固相萃取凈化依然損失較大，為了得到更加理想的目標(biāo)響應(yīng)，減少過程損失，決定繼續(xù)優(yōu)化為棄除小柱，直接提取上機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)再優(yōu)化提升響應(yīng)值

盡管過柱改良，但依然損失大，考慮使用不過柱方法，直接去除過柱的損失。稱取樣品0.5g，加內(nèi)標(biāo)100μL（1mg/L內(nèi)標(biāo)），渦旋30秒→加0.3ml0.02mol/L的醋酸銨（確保樣品完全溶解），渦旋30秒→再加4.7ml乙腈，渦旋60秒、10000r離心10分鐘→取2ml上清液，氮吹，復(fù)溶1ml（內(nèi)標(biāo)20ppb）→跑樣采用雙柱超高效液相色譜柱。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

（1）丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10mg/L）：準(zhǔn)確移取濃度液體標(biāo)準(zhǔn)品丙烯酰胺（100mg/L）1mL，加甲醇稀釋至10mL，置-20℃冰箱中保存。

（2）13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10mg/L）：準(zhǔn)確移取濃度100mg/L液體標(biāo)準(zhǔn)品13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)1mL，加甲醇稀釋至10mL，置-20℃冰箱中保存。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液II（1.0mg/L）：確移取濃度1.0ml丙烯酰胺工作液（10mg/L）與內(nèi)標(biāo)工作溶液（10mg/L）0.02mL，用0.1%甲酸水稀釋至刻度10mL，內(nèi)標(biāo)濃度為100μg/L,臨用時(shí)配置。

13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液II（0.1mg/L）：確移取13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)（10mg/L）0.02mL，用0.1%甲酸水稀釋至刻度10mL,臨用時(shí)配置。

分別移取0，1,5,10,20,50,100μL丙烯酰胺工作液II（1.0mg/L）,并用13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)工作溶液II（0.02mg/L）定容1.0mL。

1.5 儀器參考條件

（1）色譜條件：

色譜柱：2根串聯(lián)×watersC18（100×2.1mmI.D.1.7μm)。

預(yù)柱：C18保護(hù)柱（5μm、2.1mmI.D.×30mm）或等效柱。

流動(dòng)相：0.1%甲酸5mM乙酸銨溶液/甲醇/乙腈（95:3:2，體積分?jǐn)?shù)）。

流速：0.2ml/min。

進(jìn)樣體積：10μL。

柱溫：35℃。

（2）質(zhì)譜參數(shù)（三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀）參數(shù)見下表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)語

本文經(jīng)過試驗(yàn)檢驗(yàn)GB5009.204-2014方法測定油炸、烘烤食品中的丙烯酰胺，首先，對丙烯酰胺的提取條件進(jìn)行單因素的逐步優(yōu)化，包括提取試劑、小柱除雜、小柱吸收等，而關(guān)鍵步驟在于提取溶劑的挑選，最后把水更換為加10ml5mol/LNaCl溶液提取效果更佳，實(shí)驗(yàn)效果更好[3]。而最后優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，把提取溶劑換成0.02mol/L的醋酸銨提取轉(zhuǎn)換溶劑后直接上機(jī)，色譜響應(yīng)高，最低濃度能做到1ng/ml,比標(biāo)準(zhǔn)方法的濃度還低，信噪比高，對雜質(zhì)多的樣品分離效果特別好，從而獲得更優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。