乳制品細(xì)菌總數(shù)霉菌酵母快速檢驗(yàn)方法的研究

夏元鳳 劉旭 潘玉愛 周宇晨

大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院有限公司 遼寧大連 116033

乳制品細(xì)菌總數(shù)的把控，是食品衛(wèi)生安全管理的重點(diǎn)內(nèi)容，選擇科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法十分重要。目前我國的乳制品細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)中，多是選擇平板培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)大概在40h以上，檢測耗時(shí)長、成本高。面對不斷增長的檢驗(yàn)要求，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法局限性愈加明顯，無法滿足實(shí)際工作需求，迫切的需要整合乳制品檢測資源，積極推動(dòng)檢測方法創(chuàng)新優(yōu)化，力求在提升檢測效率和質(zhì)量同時(shí)，盡可能降低檢測成本。

1 乳制品細(xì)菌總數(shù)快速檢驗(yàn)方法

流式細(xì)胞法：流式細(xì)胞法（Flow Cyto metry，F(xiàn)CM）是一項(xiàng)能夠?qū)Ω邏候?qū)動(dòng)的樣品流中單個(gè)受激光照射的細(xì)胞進(jìn)行快速檢測的技術(shù)，可以用于細(xì)菌、霉菌毒素和病毒等微生物的快速檢測，在腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)和環(huán)保、水處理及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有重要的應(yīng)用。流式細(xì)胞法進(jìn)行細(xì)胞檢測具有綜合性、速度快和參數(shù)多的特點(diǎn)，該方法集合了激光、計(jì)算機(jī)和圖像等多項(xiàng)技術(shù)以及流體力學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的知識和成果，可以在1s內(nèi)對數(shù)萬個(gè)細(xì)胞的理化特性等多個(gè)參數(shù)進(jìn)行檢測。例如，Laplace-Builhe等使用FCM快速檢測酸奶和奶酪中的乳球菌；Malaerino等使用FCM檢測啤酒里存活細(xì)菌數(shù)量，并取得了和標(biāo)準(zhǔn)平板菌落計(jì)數(shù)一致的結(jié)果；FCM還可以同時(shí)檢測活菌和死亡細(xì)菌的數(shù)量。

伏安法是電勢控制法一種，這類方法電極電勢強(qiáng)制依附于已知程序，電勢控制在恒定值或按預(yù)先確定方式隨時(shí)間變化，測量電流作為時(shí)間或電勢函數(shù)。伏安法測定食品中的細(xì)菌只需半小時(shí)左右，為食品的衛(wèi)生防疫和監(jiān)督管理提供一種快速有效方法。在無菌箱內(nèi)，準(zhǔn)確吸取一定量的待測乳制品，加入預(yù)先置入細(xì)菌濾膜的微型油濾器中。開啟真空泵，迅速抽濾制成細(xì)菌阻留膜，把此膜附著在無菌罩中的玻碳電極上，插入以不同緩沖溶液為底液的反應(yīng)池中，控制電解池內(nèi)溫度為25℃，選擇不同的參比電極，以鉑電極作為輔助電極，以不同的時(shí)間進(jìn)行伏安測定，以100mV/s的掃速，在0～1.5V范圍掃描，記錄伏安掃描曲線。所得峰電流值與相應(yīng)樣品的校正工作曲線對照，計(jì)算樣品的細(xì)菌總數(shù)。

2 乳制品霉菌快速檢驗(yàn)方法

霉菌和酵母菌同屬真菌類，具有相似的生理生化特征和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此乳制品中霉菌的檢測方法與酵母菌的檢測方法類似。由表1可以看出，霉菌菌絲和孢子的直徑均在3μm以上，大于牛奶中各組分的尺寸，因此可以用孔徑為3μm的微孔濾膜過濾酸奶，以實(shí)現(xiàn)對酸奶中霉菌的富集。霉菌屬于真菌類，細(xì)胞壁分為三層，外層是無定型的β葡聚糖，中層是糖蛋白，內(nèi)層是幾丁質(zhì)纖維，與酵母菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相似，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2μL的酵母菌濃縮液用3μL0.02%濃度的次甲基藍(lán)染液染色即可達(dá)到較好的效果，始于微生物快速檢測系統(tǒng)的處理和計(jì)數(shù)。

表1 牛奶中各組分的尺寸

在無菌操作環(huán)境下，取1mL酸奶于小試管中，加入9mL生理鹽水稀釋10倍，制成待檢樣品。用無菌針管吸取5mL待檢樣品，通過孔徑為3μm的微孔濾膜過濾，然后再打入50μL無菌空氣，用針管反復(fù)吹吸幾次使?jié)饪s菌液混勻。用微量移液器取出濾膜上方2μL液體滴在玻片相應(yīng)的位置上，自然晾干后在菌膜處滴加3μL濃度為0.02%的次甲基藍(lán)染液，染色1min，用滴管吸取蒸餾水輕輕沖掉染液，晾干后插入微生物快速檢測系統(tǒng)檢測。

3 乳制品酵母快速檢驗(yàn)方法

酵母菌在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，在酸性條件下乙醇能被橙紅色的重鉻酸根離子氧化，而重鉻酸根離子還原成灰綠色的三價(jià)鉻離子。反應(yīng)方程式如下：

產(chǎn)生的Cr3+在波長為594nm光下有最大吸收峰，吸光度值與Cr3+濃度呈線性關(guān)系。由表1可知，除脂肪球以外酵母菌的尺寸跟跟牛奶中的其他組分沒有重復(fù)區(qū)域，因此可以利用1.2μm的濾膜過濾達(dá)到酵母菌富集的目的。

在超凈工作臺中，用量筒量取50mL無菌生理鹽水于錐形瓶中，加入安琪酵母0.5g，晃動(dòng)充分混勻后用棉塞封口，在恒溫培養(yǎng)箱中35℃活化30min。①酵母菌染色條件的確定。在無菌環(huán)境下用移液槍吸取上述活化酵母菌菌液2μL，在模板比對下滴于載玻片的中央位置，倒置載玻片室溫下自然晾干。將載玻片背面在酒精燈火焰上放迅速通過2-3次，以感覺不燙手為宜，此時(shí)酵母菌菌體緊貼在載玻片上。然后取3μL染液滴在載玻片上覆蓋菌膜，一段時(shí)間后用無菌水緩慢沖洗，晾干后用微生物快速檢測儀觀察。②驗(yàn)證方法的可行性。在無菌操作環(huán)境下，取1mL酸奶于試管中，用生理鹽水稀釋10倍。取1mL活化的酵母菌液加入到9mL稀釋后的酸奶中，攪拌混勻后用無菌水稀釋10倍制成待檢樣品。用注射器吸取樣品5mL，在孔徑為1.2μm的微孔濾膜上過濾，然后再向?yàn)V膜中打入50μL無菌空氣，此時(shí)微孔濾膜的上層截流液剩下20μL，反復(fù)吹吸使?jié)饪s菌液混勻，截流液即為含有酵母菌的濃縮液，過濾后用微量移液槍從過濾器中吸取2μL截流液，滴于載玻片上染色制片鏡檢。同時(shí)，吸取2μL截流液于無菌培養(yǎng)皿上，用1mL生理鹽水稀釋后，傾倒孟加拉紅培養(yǎng)基制作平板，做3個(gè)平行，在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)48h，觀察計(jì)數(shù)。吸取濾液1mL于無菌培養(yǎng)皿上，用孟加拉紅培養(yǎng)基傾倒平板，做3個(gè)平行，恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)48h，觀察計(jì)數(shù)。

4 結(jié)語

總而言之，20世紀(jì)60年代開始，許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)開始進(jìn)行微生物快速檢測技術(shù)的研究，快速檢測的試劑、試劑盒和儀器廣泛使用，但是檢測費(fèi)用昂貴。建立一種測定準(zhǔn)確、運(yùn)行成本低、操作簡便的快速檢測方法對于乳品行業(yè)來說具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這就要求我們在以后的實(shí)際工作中必須對其實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步研究探討。