周 楊,彭 聰,柯淑紅,葉正華,劉亞琪
(1.武漢市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北 武漢 430000;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢430065)
多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)是臨床常見的一種婦科疾病,其具有不能治愈、疾病進展性等特點[1-3]。目前西醫(yī)上主要采用藥物和手術(shù)對PCOS進行治療,其中藥物主要為達英-35,雖然其療效理想,但長期服藥會引起糖耐量不足,乃至加重高胰島素血癥[4]。手術(shù)治療創(chuàng)傷大,術(shù)后易發(fā)生并發(fā)癥,患者接受度并不高。我國傳統(tǒng)中醫(yī)治療PCOS療效理想,且不良反應(yīng)較少,被臨床較廣泛應(yīng)用[5]。本文選擇PCOS大鼠為模型,根據(jù)其發(fā)病機制,探討補腎活血祛痰方對高雄激素PCOS大鼠卵巢組織中類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)的影響,以期為PCOS的治療提供參考。
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物:選用21日齡的SPF級雌性健康小鼠,動物批準號:SCXK(京)2020-0009,60只,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,常規(guī)飼養(yǎng)于清潔級實驗室中[室溫(22±2)°C]。
1.1.2 藥物:脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA);補腎活血祛痰方:生山楂30 g,枸杞子20 g,煅瓦楞子、當(dāng)歸各15 g,山茱萸、黃芩各9 g,經(jīng)過水煎、過濾及濃縮成含生藥1.0 g/ml濃度藥液,-4 ℃保存待用。
1.1.3 主要試劑與儀器:黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH)試劑盒、睪酮(Testosterone,T)試劑盒、StAR及GAPDH一抗、二抗、Western blot及凝膠電泳試劑;切片機、酶標檢測儀、離心機、顯微鏡。
1.2 實驗方法
1.2.1 分組方法:將60只大鼠隨機分為對照組和中藥組,各30只。
1.2.2 造模和給藥:所有大鼠采用DHEA注射建立PCOS模型,每日注射DHEA,劑量:6 mg/100 g體重,同時注射0.2 ml油劑,連續(xù)20 d;第11天,采用陰道脫落細胞涂片檢查2個性周期(每周期為5 d),當(dāng)持續(xù)出現(xiàn)陰道上皮基底層細胞,且陰道角化細胞未曾出現(xiàn),陰道脫落細胞失去完整動情周期,則判定造模成功。造模成功后,中藥組給予補腎活血祛痰方治療:補腎活血祛痰方灌胃,1次/d,每次劑量為25 mg/(kg·d),連續(xù)灌胃22 d,對照組給予等量的0.9 %氯化鈉溶液灌胃。
1.2.3 標本采集:末次給藥后,大鼠禁食過夜,第2天水合氯醛(10%)麻醉,采集其眼眶后靜脈血,離心機離心10 min(2500 r/min),收集血清,-80 ℃超低溫冰箱保存,采用頸椎脫臼法處死大鼠,取其卵巢,常規(guī)固定和脫水后,石蠟包埋切片。
1.3 觀察項目及方法
1.3.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察:石蠟包埋切片進行HE染色,將切片放置入Harris蘇木素染中5 min,給予蘇木素染細胞核;然后切片置入伊紅染液中染色3 min,酒精梯度脫水,然后中性樹膠封片,鏡下觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)情況,包括卵泡、黃體、顆粒細胞的變化情況。
1.3.2 血清激素及炎癥水平測定:采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中LH、T、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)表達水平,嚴格按照說明書進行操作,酶標儀讀取OD值(15 min內(nèi)),并計算出LH、T、IGF-Ⅰ和TNF-α水平。
1.3.3 Western blot檢測StAR蛋白表達:改良異硫氰酸胍法提取總蛋白,然后測定蛋白濃度(Bradford比色法),調(diào)整各組蛋白濃度,保持一致,變性處理,電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)印后,置入封閉液中搖動孵育1 h,加入一抗(1∶1000稀釋)孵育,4 ℃下過夜。二抗(1∶2000稀釋)孵育2 h,免疫熒光增強法顯色,StAR蛋白的表達量與GAPDH的灰度比值表示。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 兩組大鼠卵巢組織形態(tài)情況 見表1(圖1)。HE染色結(jié)果顯示,對照組卵泡呈囊性擴張,囊狀卵泡內(nèi)卵母細胞消失,可見多個空卵泡,顆粒細胞排列極為紊亂;中藥組可見少數(shù)囊泡細胞,可見到少數(shù)初級卵母細胞、次級卵母細胞、生長卵泡以及成熟卵泡,顆粒細胞數(shù)目較對照組增多,卵泡的顆粒細胞層次多,且排列較規(guī)則,治療22 d后,中藥組的卵泡及黃體數(shù)明顯多于對照組(均P<0.05)。
圖1 兩組大鼠卵巢組織形態(tài)(HE染色,×200)
表1 兩組大鼠卵泡數(shù)及黃體數(shù)(個)
2.2 兩組大鼠血清激素水平比較 見表2。治療22 d后,中藥組血清LH和T水平比對照組明顯降低(均P<0.05)。
表2 兩組大鼠血清激素水平比較
2.3 兩組大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比較 見表3。治療22 d后,中藥組血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比對照組明顯降低(均P<0.05)。
表3 兩組大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比較
2.4 兩組大鼠卵巢組織中StAR蛋白的表達情況比較 見圖2。Western blot結(jié)果顯示,治療22 d后,中藥組卵巢組織中StAR蛋白表達(0.483±0.027)明顯比對照組(0.837±0.035)降低(P<0.05)。
1、2為對照組;3、4為中藥組
PCOS是女性最常見的一種機體代謝紊亂性疾病,以高雄激素血癥、脂代謝紊亂及高胰島素血癥為特征,會引起患者閉經(jīng)、激素水平異常增高及不孕癥狀[6-7]。PCOS的發(fā)病機制目前尚未完全清楚,內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗等因素均可導(dǎo)致其發(fā)病[8-9]。高雄激素血癥會阻礙PCOS患者卵泡成熟,使卵泡閉鎖,導(dǎo)致發(fā)生囊性病變[10]。PCOS在我國傳統(tǒng)中醫(yī)中屬于“閉經(jīng)”“癥瘕”“不孕”“崩漏”范疇,認為其發(fā)病機制為,患者腎精虧虛、腎氣虛衰導(dǎo)致排卵稀發(fā)或不排卵,腎虛日久導(dǎo)致任脈不通、沖脈不足,經(jīng)血不能匯集下注胞宮,導(dǎo)致月經(jīng)后期,甚至閉經(jīng)[11]。因此治療以補腎為主,兼活血化瘀,祛濕除痰[12]。
卵巢是女性儲備卵子及產(chǎn)生激素的生殖器官,卵泡是其最基本功能單位,承擔(dān)著儲備營養(yǎng)物質(zhì)與傳遞遺傳物質(zhì)的作用[13]。補腎活血祛痰方由生山楂、枸杞子、煅瓦楞子、當(dāng)歸、山茱萸、黃芩組成。其中生山楂具有活血化瘀、消食化積的功效;枸杞子具有滋補肝腎、明目潤肺的效果;煅瓦楞子可起到化瘀散結(jié)、消痰軟堅的作用;當(dāng)歸具有補血活血調(diào)經(jīng)的功效;山茱萸具有澀精固脫、補肝腎的功效;黃芩具有瀉火解毒、清熱燥濕的作用,以上諸藥共用,可起到補腎活血、祛痰利濕的效果[14-15]。本研究將其用于PCOS大鼠身上,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥治療22 d后,中藥組卵泡顆粒細胞數(shù)目較對照組增多,卵泡的顆粒細胞層次多,且排列較規(guī)則,卵泡及黃體數(shù)明顯多于對照組,這說明了補腎活血祛痰方可明顯促進大鼠卵泡的發(fā)育,誘發(fā)排卵,改善黃體形成,并改善卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu),從而改善卵巢的生殖功能。
高雄激素血癥可以引起機體下丘腦-垂體-卵巢軸功能發(fā)生紊亂,導(dǎo)致LH水平升高,使高雄激素的活性增強,促進PCOS患者的卵巢分泌雄激素,加重高雄激素血癥[16-17]?,F(xiàn)代藥理學(xué)認為[18-19],山楂、當(dāng)歸這些活血化瘀藥中的有效成分可改善微循環(huán),增加血流量,改善組織供養(yǎng);枸杞子等補腎類藥物可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸功能,起到類雌激素樣作用。StAR是一種甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白,其在甾體激素產(chǎn)生的過程中起到關(guān)鍵作用,對調(diào)控血清激素水平有著重要作用[20]。當(dāng)IGF-Ⅰ水平異常升高時,IGF-Ⅰ的類似胰島素功能也發(fā)生變化,機體新陳代謝異常、雄激素水平上升,增加胰島素抵抗,導(dǎo)致PCOS發(fā)生。TNF-α是重要的促炎細胞因子之一,且在PCOS的患者中表達增高。本研究結(jié)果顯示,治療后,中藥組血清LH和T水平比對照組明顯降低,中藥組StAR蛋白表達明顯比對照組降低,這可能是因為通過補腎活血祛痰方治療,可增強卵巢局部血液循環(huán),增進其血流量,改善胰島素抵抗,調(diào)控血清激素水平,減輕胰島素抵抗;通過改善卵巢局部環(huán)境,影響StAR和類固醇激素及其合成酶的合成,下調(diào)StAR蛋白的表達。
綜上所述,補腎活血祛痰方可有效降低高雄激素PCOS大鼠血清激素水平,下調(diào)StAR蛋白的表達,改善卵巢功能,可為臨床治療PCOS提供一定的實驗依據(jù)。