車前草高效再生體系的建立

楊鴻淋，張欣鈺，何金玉，鄒利娟

(綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽 621006)

0 引言

車前草(PlantagoasiaticaL.)為車前草屬多年生草本植物，又名車輪草、豬耳草、牛耳朵草等，具有極高的藥用價值和食用價值[1-2].車前草主要含有黃酮類、多糖類、三萜類等化學(xué)成分，具有抗菌消炎、消腫利尿、清熱明目、涼血解毒、鎮(zhèn)咳抗炎等功能，在臨床上常用于治療流行性腮腺炎、尿潴留、慢性活動性肝炎、痛風(fēng)與細(xì)菌性痢疾等[3-4].隨著現(xiàn)代藥理研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)車前草所含的多種成分都有抗腫瘤、抗突變、抗氧化和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化、增強(qiáng)細(xì)胞免疫力等作用[5-6].車前草具有多種化學(xué)成分類型和廣泛的藥理作用[7-8].同時車前草作為可食用性蔬菜，市場需求量極大，人們的過度采挖導(dǎo)致野生車前草資源量驟然下降.

對于車前草組織培養(yǎng)已有報道，李平等以大車前草子葉和葉片誘導(dǎo)再生芽[9]；曾建軍等以車前草下胚軸和子葉為外植體誘導(dǎo)不定芽[10]；王曉旭等以平車前草根頸、葉片和葉柄為外植體，建立了車前草再生體系[11-12]，這些數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)提供了重要參考，但不同外植體在含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率和增殖效果也有很大差異.本實(shí)驗(yàn)以車前草為對象，以規(guī)?；a(chǎn)為目的，系統(tǒng)探討植物生長調(diào)節(jié)劑組合對幼芽和葉片愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、增殖及生根培養(yǎng)的影響，篩選出不同階段的最佳培養(yǎng)基，從而成功建立完整的車前草再生體系.本實(shí)驗(yàn)對于保護(hù)車前草植物資源、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)利用，研究次生代謝物質(zhì)生物合成機(jī)制、實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等，具有一定的參考價值.此外，為利用基因工程對車前草進(jìn)行遺傳改造，培育高活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株提供了研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

車前草種子，2020年9月采于綿陽市磨家鎮(zhèn)，經(jīng)綿陽師范學(xué)院羅明華教授鑒定.將收集的車前草種子播種于實(shí)驗(yàn)室營養(yǎng)土中，待植株長至4～6葉片時取其幼芽作為外植體，用75%酒精消毒30 s，再用10%NaClO滅菌6～8 min，無菌水洗滌3～5次，無菌濾紙瀝干水分后備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從生芽誘導(dǎo)：幼芽接種于含有生長素NAA(萘乙酸)，細(xì)胞分裂素KT(激動素)和TDZ(噻苯隆)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng).20 d后統(tǒng)計幼芽誘導(dǎo)叢生芽情況.

愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)：待接種后的幼芽有新的葉片長出，將無菌葉片剪為0.5 cm×0.5 cm大小，進(jìn)行葉片愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織經(jīng)過增殖培養(yǎng)后進(jìn)行不定芽分化.葉片接種15 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率，第35天后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)狀況.

再生芽增殖：將獲得的再生芽轉(zhuǎn)接至TDZ2.0 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行芽的生長增殖.

生根及移栽：獲得的再生芽轉(zhuǎn)移至添加IAA(吲哚乙酸)、NAA和ZT(玉米素)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根.生根培養(yǎng)3周后進(jìn)行馴化移栽.

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

供試培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基添加3%蔗糖和0.6%瓊脂，pH5.8±0.2并于121 ℃滅菌20 min.培養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃，光照時間12 h/d，光照強(qiáng)度3 000 lx.

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽的誘導(dǎo)(幼芽)

車前草幼芽(圖1)接種在供試的12種培養(yǎng)基上，統(tǒng)計結(jié)果見表1，供試的12種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)車前草叢生芽的產(chǎn)生，但誘導(dǎo)率和每個外植體產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)存在很大的差異.幼芽誘導(dǎo)叢生芽生長過程記錄如下：接種15 d左右，幼芽基部開始膨大；約20 d，芽體基部產(chǎn)生大量綠色致密愈傷組織(圖1-B1)，此時統(tǒng)計誘導(dǎo)率；在原培養(yǎng)基上繼續(xù)轉(zhuǎn)接，35 d左右愈傷組織分化出綠色小芽體(圖2-B2)，基部愈傷部分褐化；45 d后芽體不斷分化增長(圖2-B3)，此時由于愈傷團(tuán)較大，吸收營養(yǎng)有限，可以切割成小團(tuán)，分別接種在原培養(yǎng)基培養(yǎng)，60 d后發(fā)育成健壯的無菌苗(圖2-B4).

12種處理中，1-6號培養(yǎng)基使用生長素NAA和細(xì)胞分裂素TDZ，7-12號培養(yǎng)基使用生長素NAA和細(xì)胞分裂素KT，數(shù)據(jù)分析分析得出：無論是誘導(dǎo)率還是產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)，NAA配比TDZ的使用效果要比NAA和KT組合的使用效果好.其中5號培養(yǎng)基誘導(dǎo)率達(dá)89.3%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽不僅數(shù)量多，而且長勢最好，葉片大而深綠，平均芽達(dá)到35.2個，和其他處理均存在顯著差異.因此，叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA0.5 mg/L+TDZ2.0 mg/L，TDZ作為細(xì)胞分裂素更適合車前草誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生.

2.2 不定芽的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)(葉片)

車前草幼芽(圖1-B)接種于培養(yǎng)基MS+NAA0.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L上，幼芽不斷伸長生長葉片伸展，15 d左右可獲得大量無菌葉片，將葉片切割成0.5 cm×0.5 cm大小，進(jìn)行葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo).葉片誘導(dǎo)愈傷及分化過程記錄如下：接種7 d葉片卷曲膨大；15 d后葉片切口處出現(xiàn)少量愈傷組織(圖1-A1)，切口處有褐化；約24 d，切口處愈傷組織分化不定芽(圖2-A2)；不定芽增殖分化，將不定芽切割成芽從在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)32 d(圖2-A3)；60 d后芽長成可見健壯芽從(圖2-A4).

由表2可知，12種處理中，均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織.IAA+ZT培養(yǎng)基與IAA+TDZ培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果(愈傷誘導(dǎo)率和不定芽平均個數(shù))存在顯著差異.其中11號培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)91.7%，不定芽分化率為61.2%，每個外植體產(chǎn)生的不定芽平均數(shù)為14.2個，與其他處理均存在顯著差異.因此，葉片愈傷組織及分化的最佳培養(yǎng)基為MS+IAA0.5 mg/L+TDZ2.0 mg/L，細(xì)胞分裂素TDZ更適合車前草葉片誘導(dǎo)及分化.葉片愈傷組織繼代可添加AgNO3500 mg/L，有效防止褐化和提高不定芽分化.

將獲得的不定芽切割成含2～4個芽的芽從，轉(zhuǎn)接到含有TDZ(1.0、2.0、3.0 mg/L)和AgNO3500 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)(表3)，無菌苗長勢良好(圖3-ABC)，褐化現(xiàn)象得到緩解.在2.0 mg/L的TDZ培養(yǎng)基上，再生芽的增殖系數(shù)達(dá)7.2，與其他處理存在顯著差異.

圖3 不定芽增殖及生根培養(yǎng)Fig.3 Adventitious bud proliferation and rooting cultureA-TDZ1.0 mg/L +AgNO3500 mg/L不定芽增殖；B-TDZ3.0 mg/L +AgNO3500 mg/L不定芽增殖；C-TDZ2.0 mg/L +AgNO3500 mg/L不定芽增殖；D-生根培養(yǎng)

2.3 生根培養(yǎng)

將生長健壯的叢生芽或不定芽切割成單芽接種到生根培養(yǎng)基中，每種處理接種15個單芽.培養(yǎng)28 d后的統(tǒng)計結(jié)果見表4.由表可見，車前草生根較容易，生根培養(yǎng)15 d后，各組培養(yǎng)基中的芽均開始有根長出，但由于各組培養(yǎng)基的激素組合和配比不同，生長狀況也各有差異.各培養(yǎng)基之間平均根長和誘導(dǎo)率差別不大，1號和2號僅添加了生長素NAA，但生根狀況不佳，不僅根少，而且苗生長狀況不好，部分泛黃；3號和4號僅添加了生長素IAA，雖然根較多，但主要為須根，主根不明顯，苗的長勢較好；5號添加了生長素IAA和細(xì)胞分裂素ZT，平均根長、生根條數(shù)及誘導(dǎo)率均高于其他處理，有生長粗壯明顯的綠色主根，且苗的長勢良好(圖3-D).綜合比較，車前草生根最佳培養(yǎng)基為MS+IAA1.0 mg/L+ZT2.0 mg/L，在此培養(yǎng)基上，生根誘導(dǎo)率100%，平均根長7.9 cm，平均根數(shù)30條.組培苗經(jīng)馴化移栽后成活率可達(dá)100%.

表4 不同激素配比組合對生根誘導(dǎo)的影響Tab.4 The effect of different assemblage with hormone concentration on rooting induction

3 討論

3.1 TDZ對不定芽、叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)的影響

車前草屬的組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)中，多以下胚軸直接誘導(dǎo)叢生芽，子葉、葉片、葉柄與根頸先經(jīng)愈傷組織再分化不定芽，但愈傷組織分化率和分化成芽數(shù)較低，分化率為25%，平均每塊愈傷產(chǎn)生2.8個芽[9-12].本實(shí)驗(yàn)中葉片經(jīng)愈傷組織在MS+IAA0.5 mg/L+TDZ2.0 mg/L培養(yǎng)基上分化率可達(dá)61.2%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽平均數(shù)為14.2個.這可能與使用的植物生長調(diào)節(jié)劑不同，TDZ作為類似細(xì)胞分裂素在芽的誘導(dǎo)和植株再生方面具有較強(qiáng)的活性，能夠誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生直接不定芽，并在眾多的工作中得到了證實(shí)[13-14].本研究在進(jìn)行叢生芽、不定芽的誘導(dǎo)過程中，生長素IAA和細(xì)胞分裂素TDZ或KT的不同組合中，TDZ的效果比KT的效果更好.且較高濃度細(xì)胞分裂素利于芽的形成，但是細(xì)胞分裂素的濃度也不宜過高，在誘導(dǎo)不定芽、叢生芽的12種培養(yǎng)基組合中(表1和表2)，4-6號隨編號的增大TDZ的濃度也逐漸增大，但對芽誘導(dǎo)效果卻并未逐漸增強(qiáng)，6號的效果反而比5號差.因此，本研究中誘導(dǎo)叢生芽的TDZ的最佳濃度為2.0 mg/L，即誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽的最佳培養(yǎng)基為5號培養(yǎng)基MS+(IAA0.5+TDZ2.0)mg/L，誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽健壯，葉片碩大且顏色深綠；誘導(dǎo)不定芽的TDZ最佳濃度為2.0 mg/L，誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+(IAA1.0+TDZ2.0)mg/L，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽長勢最好.本實(shí)驗(yàn)建立的車前草再生體系，可以滿足大規(guī)模市場化的生產(chǎn)，并為利用基因工程對車前草進(jìn)行遺傳改造及種質(zhì)資源保護(hù)提供了理論參考.

3.2 實(shí)驗(yàn)中玻璃化現(xiàn)象

玻璃化是指植物在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的一種形態(tài)和生理紊亂，由于水分?jǐn)z入過多，導(dǎo)致葉片呈半透明、腫脹、卷曲、易碎的狀態(tài).產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象與外植體狀態(tài)、通風(fēng)條件、溫度、光照以及培養(yǎng)基成分等因素有關(guān)[15-16].本實(shí)驗(yàn)在葉片分化不定芽培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)了部分玻璃化現(xiàn)象(圖2-A3).研究證明，通過增加植物的抗氧化作用或消除過氧化物及活性氧自由基可有效減少組培苗的玻璃化[16].本實(shí)驗(yàn)中在葉片愈傷組織繼代及芽從增殖培養(yǎng)基中分別加入500 mg/LAgNO3和500 mg/L抗壞血酸后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加入500 mg/LAgNO3的培養(yǎng)基中明顯緩解組培苗玻璃化現(xiàn)象.