LAMP法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)下呼吸道感染常見(jiàn)病原體的比較研究

徐曉娜 孫 昕 王莉莉 董全江 李培杰

據(jù)世界衛(wèi)生組織(world heath organization，WHO)2018年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界十大死亡原因中，下呼吸道感染排第4位，低收入國(guó)家十大死因中，下呼吸道感染位居第一。引起呼吸道感染的病原體主要有細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等，下呼吸道感染病死率居高不下的主要原因是沒(méi)有獲得快速準(zhǔn)確的診斷和治療。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)主要靠細(xì)菌培養(yǎng)或免疫學(xué)方法，傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然是診斷下呼吸道感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在很多缺陷：細(xì)菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，每次只能鑒定一種病原體，對(duì)特殊病原體如流感嗜血桿菌、肺炎支原體等的檢測(cè)能力弱。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，并可同時(shí)檢測(cè)13種常見(jiàn)下呼吸道感染病原體等優(yōu)點(diǎn)，本研究利用LAMP芯片技術(shù)，分析青島市市立醫(yī)院住院的疑似下呼吸道感染患者病原菌分布情況，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，分析評(píng)價(jià)LAMP芯片法檢測(cè)下呼吸道病原體的效果。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2019年7～12月在青島市市立醫(yī)院住院的疑似下呼吸道感染患者痰液標(biāo)本2 430例，其中男性1 440例，女性990例，年齡1～99歲，平均(64.2±17.5)歲。采用自然咳痰或氣管插管收集深部濃痰于無(wú)菌容器送檢。合格的痰液要求：白細(xì)胞數(shù)>25個(gè)/低倍視野，且上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍視野。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法細(xì)菌學(xué)檢查 病原菌分離和培養(yǎng)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行，羊血瓊脂平板和麥康凱平板均為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。細(xì)菌鑒定采用BD公司Poenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。質(zhì)量控制菌株銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，糞腸球菌ATCC29212均購(gòu)自美國(guó)Micro Biologies公司。

1.2.2 LAMP芯片法核酸檢測(cè) 參照晶芯?呼吸道病原菌核酸檢測(cè)(LAMP芯片法)試劑盒說(shuō)明書(shū)，向無(wú)菌容器內(nèi)的痰標(biāo)本中加入等體積的10% NaOH，充分振蕩混勻，37℃液化30 min，取1 mL液化后液體離心棄上清，洗滌，加入核酸提取液提取DNA備用。取痰液DNA 34.5 μL與20 μL恒溫?cái)U(kuò)增試劑混勻，取50 μL上述配好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系加入芯片，離心，用RTisochip-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀(博奧生物集團(tuán)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增條件設(shè)為：37℃預(yù)熱3 min，65℃ 47 min擴(kuò)增，結(jié)果用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析。本試劑盒的每個(gè)芯片均設(shè)有24個(gè)反應(yīng)池(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，每個(gè)反應(yīng)池包埋固定一套引物用于一種核酸靶序列的擴(kuò)增與檢測(cè)，其中包括1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控、9個(gè)陰性質(zhì)控和13個(gè)病原菌反應(yīng)池，可一步完成對(duì)13種常見(jiàn)下呼吸道病原菌的檢測(cè)，包括肺炎衣原體、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌。

圖1 碟式芯片結(jié)構(gòu)圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用

χ

檢驗(yàn)；痰培養(yǎng)與LAMP芯片法檢驗(yàn)結(jié)果的一致性分析采用Kappa分析，0.0～0.20表示極低的一致性，0.21～0.40表示一致性一般，0.41～0.60表示一致性中等，0.61～0.80表示高度一致性，0.81～1表示幾乎完全一致。以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP法對(duì)下呼吸道感染常見(jiàn)病原體檢出情況 2 430例下呼吸道感染痰液標(biāo)本，LAMP法檢出陽(yáng)性標(biāo)本1 132例，總陽(yáng)性率為46.58%。單一病原體感染653例(26.87%)，混合感染479例(19.71%)，其中兩種病原體混合感染317例(13.05%)，三種病原體混合感染112例(4.61%)；共檢出呼吸道病原體12種，其中流感嗜血桿菌陽(yáng)性率最高，嗜肺軍團(tuán)菌未檢出。見(jiàn)表1。

表1 2 430例呼吸道標(biāo)本病原體檢出情況

2.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)下呼吸道感染常見(jiàn)病原體檢出情況 1 905例下呼吸道感染痰液標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)病原體均為優(yōu)勢(shì)菌株，排除了混合菌株感染，共檢出陽(yáng)性440例，陽(yáng)性率23.10%，單一病原體感染338例(17.74%)，混合感染102例(5.35%)，其中兩種病原體混合感染84例(4.41%)，三種病原混合感染14例(0.73%)。見(jiàn)表2。

表2 1 905例呼吸道標(biāo)本病原體檢出情況

2.3 LAMP法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽(yáng)性率及陽(yáng)性符合率一致性比較 1 905例下呼吸道感染痰液標(biāo)本同時(shí)行LAMP法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)病原體，LAMP法陽(yáng)性率為48.38%，顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法(23.10%)(

χ

=341.815，

P

<0.05)。兩種方法總體陽(yáng)性符合率的Kappa>0.4。見(jiàn)表3。LAMP芯片法檢測(cè)的每種病原體陽(yáng)性率均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法(

P

<0.05)。兩種方法檢出銅綠假單胞菌的陽(yáng)性率有高度一致性(Kappa=0.658)，鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌陽(yáng)性率有中等一致性(0.4

表3 LAMP法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽(yáng)性率及陽(yáng)性符合率一致性比較(例)

表4 LAMP法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)到8種致病菌的陽(yáng)性率

3 討論

下呼吸道感染是一個(gè)全球范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，它常為多種呼吸系統(tǒng)疾病的誘因，并涉及種類繁多的病原體，下呼吸道感染的持續(xù)進(jìn)展，能夠?qū)е禄颊咧匕Y肺炎或者膿毒血癥的發(fā)生，增加了患者不良心肺結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前，在短時(shí)間內(nèi)做出明確的病原學(xué)診斷并進(jìn)行有針對(duì)性的治療依然很困難，這也是該病死亡率高的主要原因。LAMP芯片技術(shù)是Notomi等在2000年開(kāi)發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，通過(guò)鏈置換DNA 聚合酶，在約65℃恒溫條件下可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP芯片技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，并可同時(shí)檢測(cè)13種常見(jiàn)下呼吸道感染病原體，最快2 h即可檢出病原菌等優(yōu)點(diǎn)。本研究LAMP芯片法共檢測(cè)2 430例下呼吸道感染痰液標(biāo)本，陽(yáng)性率46.58%，流感嗜血桿菌(16.30%)是主要下呼吸道致病菌，與劉志遠(yuǎn)等、李素娟等、蔣麗莉等研究結(jié)果一致。而王勝等、陳艷玲的研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌是下呼吸道感染的主要病原菌，王帆等、王淑玲等研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌是下呼吸道感染的主要病原菌，與本研究結(jié)果不同。分析原因可能和納入的人群年齡結(jié)構(gòu)和來(lái)源有很大關(guān)系，中國(guó)各地區(qū)氣候及空氣污染程度不同也是造成病原體感染率存在差異的重要因素，另外這種差異還可能受經(jīng)濟(jì)差異以及臨床醫(yī)師用藥習(xí)慣的影響，標(biāo)本的采集方法、醫(yī)院的診療水平和所用的檢測(cè)方法也可對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，具體原因有待進(jìn)一步研究探討。

本研究結(jié)果顯示，LAMP法總陽(yáng)性率(48.38%)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法總陽(yáng)性率(23.10%)，且LAMP法檢出的8種病原菌陽(yáng)性率均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，與之前的研究報(bào)道類似，分析原因：①傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)對(duì)于樣本來(lái)源、樣本條件、操作要求等多方面要求較高，導(dǎo)致陽(yáng)性率不高；②LAMP芯片法能夠從極微量的病原體遺傳物質(zhì)中進(jìn)行拷貝和擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度較高；③有些病原體如流感嗜血桿菌，服藥后培養(yǎng)陽(yáng)性率會(huì)降低。LAMP芯片法檢出的主要病原菌前3位分別為流感嗜血桿菌(16.30%)、肺炎克雷伯菌(9.75%)和耐甲氧西林葡萄球菌(9.05%)，與趙溜的研究結(jié)果一致。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢出的主要病原菌為銅綠假單胞菌124例(6.51%)、鮑曼不動(dòng)桿菌117例(6.14%)、肺炎克雷伯菌105例(5.51%)，而黃紅春等研究發(fā)現(xiàn)，檢出率居前3位的致病細(xì)菌依次為肺炎克雷伯菌126株(33.07%)、鮑曼不動(dòng)桿菌83株 (21.78%)、銅綠假單胞菌49株(12.86%)。本研究LAMP芯片法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果具有中等一致性，其中銅綠假單胞菌的陽(yáng)性檢出率具有高度的一致性，其次是鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌陽(yáng)性率有中等一致性，而苛養(yǎng)菌(肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌)陽(yáng)性率一致性較低，與魏曉楠等研究結(jié)果一致。由于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌對(duì)培養(yǎng)條件要求較苛刻，在普通培養(yǎng)基中難以生存，故痰培養(yǎng)陽(yáng)性率低，LAMP法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯升高，2者陽(yáng)性率無(wú)一致性，與Sekim 等研究吻合。同樣，王詠紅等研究發(fā)現(xiàn)LAMP法對(duì)病原體的檢出率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，特別是對(duì)于流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。鄭東宇等測(cè)序結(jié)果分析顯示，LAMP擴(kuò)增區(qū)不同菌株序列一致性約為95%，具有很好的保守性，核酸檢測(cè)技術(shù)的敏感度高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。

綜上所述，LAMP芯片法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，能夠快速診斷下呼吸道感染病原菌，提高陽(yáng)性率并同時(shí)檢測(cè)支原體、衣原體和軍團(tuán)菌等非典型病原體，達(dá)到快速診斷的目的，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免延誤最佳治療時(shí)機(jī)。但本研究也存在一定局限性，如檢測(cè)病例數(shù)較少，對(duì)象主要來(lái)源于同一醫(yī)院的住院患者，后期還需要增加樣本量，擴(kuò)大研究規(guī)模，爭(zhēng)取為本地區(qū)乃至全國(guó)提供可靠的呼吸道感染病原體流行趨勢(shì)。

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